배양된 대식세포 내 Leishmania Virulence 평가

초록

출처: Sarkar, A. et al., 대식세포 내 세포 내 성장의 정량화는 리슈마니아 기생충의 독성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법입니다.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 대식세포를 메타고리 전구세포로 처리하여 세포 내 변형체를 형성함으로써 리슈마니아의 독성을 조사합니다. 리슈마니아의 독성은 핵산 형광 염료 염색을 통해 확인됩니다. 이러한 통찰력은 리슈마니아증에 대한 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 골수 유래 대식세포(BMM)의 분리 및 분화

1. 0일차: CO₂ 챔버에서 4-6주 된 암컷 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스를 희생하고 경추 탈구로 인한 사망을 확인합니다. 가위와 집게를 70% 에탄올에 담가 두어 살균을 확인하십시오. 장갑에 70% 에탄올을 분사하여 골수 세포 분리 과정 전반에 걸쳐 멸균 취급이 가능합니다.
2. 희생된 쥐의 앞다리를 고정하고 70% 에탄올을 듬뿍 뿌려 소독하여 해부판에 고정합니다.
3. 고관절 부근을 가위로 작게 절개(약 1cm) 합니다. 피부 아래에 가위를 조심스럽게 삽입하여 밑에 있는 근육을 분리하고 고관절 주위의 피부를 자릅니다.
   메모: 박리 보드는 고관절에 대한 접근을 개선하기 위해 회전할 수 있습니다.
4. 다리에서 발목 쪽으로 당겨 제거하여 조심스럽게 장갑을 낀 피부를 제거합니다. 발목에서 발을 자르고 경골이 완전히 손상되지 않도록 발목 관절 또는 아래를 자르도록 매우 조심합니다.
   메모: 이 단계의 비골은 느슨하게 부착되어 있으며 겸자로 쉽게 분리할 수 있습니다.
5. 회전 지점을 식별하기 위해 대퇴골을 조작하여 고관절을 수동으로 찾습니다. 조심스럽게 가위를 사용하여 고관절 위의 다리를 절단하여 대퇴골의 근위두를 그대로 둡니다.
6. 가위로 다리에서 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 제거하십시오. 발목에 남아 있는 피부와 고관절 위의 여분의 뼈 물질을 제거합니다.
7. 깨끗이 씻은 다리 뼈를 멸균된 Roswell Park Memorial Institute RPMI에 넣고 페니실린/스트렙토마이신(최종 농도 1%)을 보충한 페트리 접시에 얼음 위에 놓습니다.
8. 1.4-1.6단계를 반복하여 다른 뒷다리에서 경골과 대퇴골을 분리합니다.
9. 멸균된 집게와 멸균 #10 블레이드를 사용하여 RPMI에 담근 뼈에서 남아 있는 근육과 결합 조직을 제거합니다.
10. 페트리 접시 뚜껑에 뼈를 놓습니다. 골수에 접근하기 위해 발목 관절 바로 위의 칼날로 경골을 조심스럽게 자릅니다. 무릎 관절 바로 아래를 잘라 다리의 나머지 부분에서 경골을 제거합니다.
11. 페니실린/스트렙토마이신(1% 최종 농도)이 보충된 10mL 멸균 RPMI를 10mL 주사기에 추출하고 25G 바늘을 부착합니다.
12. 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브 위에 집게로 경골을 수직으로 단단히 잡습니다. 주사기를 사용하여 약 5mL RPMI를 뼈 끝에 부드럽게 주입하여 다른 쪽 끝에서 원뿔형 튜브로 골수를 씻어냅니다. 뼈가 하얗게 변할 때까지 총 10mL RPMI로 골수를 씻어냅니다.
    메모: 완전히 씻어낸 후에는 뼈가 하얗게 변해야 합니다. 그렇지 않은 경우 계속 세척하여 골수를 제거하십시오. 경골의 말단부가 너무 좁아서 바늘을 삽입할 수 없는 경우 날로 다시 다듬어야 할 수도 있습니다.
13. 무릎 관절 바로 위와 엉덩이 관절 바로 아래의 대퇴골을 절단하여 뼈의 양쪽 끝이 골수에 접근할 수 있도록 노출시킵니다. 경골과 동일한 방식으로 총 10mL RPMI로 대퇴골에서 골수를 씻어냅니다.
14. 나머지 뼈에 대해 세척 및 세척 단계 1.6에서 1.13을 반복하고 단일 50mL 원뿔형 튜브
    에 골수 세척 세포를 수집합니다. 메모: 뼈를 씻어내기 전에 해부 중 어느 시점에서든 뼈가 부러진 경우 이 뼈의 골수를 사용하지 마십시오.
15. 원심분리기: 4개의 뼈에서 씻겨진 골수를 채취하는 데 사용되는 원뿔형 튜브를 4°C, 300 x g에서 10분 동안
채취합니다.
16. 60mL의 멸균 BMM 배지(최종 농도 20% 소 태아 혈청, FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1.2mM Na-피루브산, 25μg/mL 인간 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)의 RPMI)를 필터 캡이 있는 175cm²세포 배양 플라스크에 넣습니다.
17. 원심분리 후 상등액을 버리고 플라스크에서 5mL의 BMM 배지를 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
18. 세포 현탁액을 배양 플라스크로 옮기고 배양 플라스크의 BMM 배지로 원뿔형 튜브를 두 번 헹구어 세포 회수를 극대화합니다. 세포 현탁액이 배지에 완전히 혼합되었는지 확인하고 초기 175cm² 세포 배양 플라스크에서 필터 캡이 있는 두 번째 175cm² 세포 배양 플라스크로 30mL를 분배합니다.
19. 30mL 세포 현탁액이 포함된 두 플라스크를 각각 37°C, 5% 이산화탄소(CO₂)에서 하룻밤 동안 배양하여 오염된 섬유아세포, 상주 대식세포 및 기타 부착 세포를 분리할 수 있습니다.
20. DAY 1: 플라스크에서 미분화 골수 세포를 포함하는 상등액을 약 10mL/접시로 100mm x 15mm 비TC 처리된 폴리스티렌 페트리 접시로 옮기고 37°C, 5% CO₂에서 배양합니다.플라스크를 버립니다.
21. 3일차 또는 4일차: 각 페트리 접시에 5mL BMM 배지(37°C로 예열)를 추가하고 37°C, 5% CO₂에서 배양을 계속합니다.

2. 감염을 위한 커버슬립에 BMM 도금(DAY 7 또는 8)

1. 각 빈 웰의 바닥에 4개의 멸균 12mm 유리 커버슬립(고압 멸균 및 밀폐된 유리 용기에 보관)을 배치하여 6웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다.
   메모: 각 멸균 12mm 커버슬립을 진공 라인에 장착된 흡입 팁으로 선택합니다. 커버슬립을 겹치지 않게 웰에 놓고 튜브를 꼬집어 진공을 중단하여 원하는 위치에 놓습니다.
2. 부착 골수 유래 대식 세포로 코팅 된 Petri 접시의 배지 (및 비 부착 세포)를 흡인하고 부착 세포를 37 ° C로 예열 된 칼슘 및 염화마그네슘이 없는 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS -/-)로 2x 부드럽게 헹굽니다.
3. 최종 농도가 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)인 5mL 멸균 1x PBS -/-를 각 페트리 접시에 적가하고 37°C에서 5분 동안 배양하여 부착 BMM을 분리합니다.현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.
4. 50mL 원뿔형 튜브에 1mM EDTA가 보충된 1x PBS에 현탁된 모든 분리된 세포를 수집합니다. 각 접시를 5mL PBS -/-로 2x 헹구고 세포 현탁액 풀에 추가합니다.
   메모: 세포 현탁액은 수집 과정에서 EDTA 독성으로부터 대식세포를 보호하기 위해 추가 PBS -/-로 희석할 수 있습니다.
5. 300 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 피펫팅으로 5 - 10 mL BMM 배지에 대식세포를 재현탁합니다. 튜브에 달라붙거나 뭉치는 것을 방지하기 위해 부유 세포를 얼음 위에 놓습니다.
6. hemocytometer.
   에서 Trypan blue exclusion을 사용하여 생존 가능한 세포 계수 메모: 5 mL 배지에 재현탁된 BMM 세포를 계수하기 위해 445 μL PBS -/-의 25 μL 세포 현탁액과 30 μL 0.4% Trypan blue 용액의 희석 혼합물을 사용하면 일반적으로 혈구계에서 쉽게 정량화할 수 있습니다(최종 계산을 위해 20배 희석 계수 고려). Trypan blue로 염색되지 않은 세포(생존 가능한 세포)만 계수합니다. 세포 현탁액의 부피는 이 혼합물이 너무 농축되거나 희석되는 경우 변경될 수 있습니다. 일반적으로 제제당 BMM의 수율은 단일 마우스에서 2 x 10⁷ 세포와 5 x 10⁷ 세포 사이에서 다양합니다.
7. 원하는 도금 농도(5 x 10⁵/mL)의 BMM 배지에서 세포 현탁액을 준비하고 각 웰이 1 x 10⁶ 대식세포를 수용하도록 웰당 2mL 배지의 6웰 플레이트에 현탁액을 분산시킵니다.
   메모: 이것은 모든 웰이 커버슬립을 균일하게 덮을 수 있는 적절한 수의 대식세포를 얻을 수 있도록 하는 중요한 단계입니다. 웰의 커버슬립이 매체에서 겹치거나 떠 있지 않은지 확인하십시오. 그렇다면 멸균 피펫 팁으로 부드럽게 조정하십시오.
8. 37 ° C, 5 % CO₂에서 밤새 배양하십시오.

3. 리슈마니아아마조넨시스의 감염성 정제

참고: 리슈마니아의 감염을 준비합니다- 고정 프로마스티고트 배양에서 메타사이클릭 프로마스티고트를 정제하거나, 표준 L. amazonensis axenic 분화 프로토콜을 사용하여 배양된 프로마스티고트를 아마스티고트 형태로 분화합니다.

1. Purification of Leishmania metacyclic promastigotes(Density Gradient media(Materials)를 이용한 정제
   1. 밀도 구배 매체의 40% 원액을 내독소가 없는 멸균수에서 준비합니다.
   2. 밀도 구배 용액을 10x M199 배지(혈청 제외)에 희석하여 M199 배지에서 10% 농도를 준비합니다.
   3. 0.22μm 필터를 통해 모든 용액을 필터링합니다.
      메모: 원액은 4°C의 암흑 속에서 1개월 이상 보관할 수 없습니다.
   4. 15mL 코니컬 원심분리 튜브 바닥에 2mL의 40% 밀도 구배 배지 용액을 추가합니다.
   5. 파스퇴르 피펫을 사용하여 두 층 사이의 혼합을 방지하기 위해 파스퇴르 피펫을 사용하여 조심스럽게 M199의 10% 밀도 구배 매체 용액 2mL를 층화합니다.
   6. 1,900 x g에서 10분 동안 원심분리를 통해 고정상 배양에서 1 x 10⁹ 기생충을 수집합니다.
   7. 6mL Dulbecco의 변형 필수 배지(DMEM)에서 세포를 재현탁합니다.
   8. 세포 현탁액 2mL를 10% 밀도 구배 배지 층 바로 위에 층을 이루고, 층 간 혼합을 방지하기 위해 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 층을 이
   룹니다.
   9. 실온에서 1,300 x g에서 10분 동안 그래디언트를 원심분리합니다.
      메모: 리슈마니아 종 간의 물리적 특성의 차이로 인해 최대 수율을 보장하기 위해 각각에 대한 원심분리 조건을 약간 조정해야 할 수도 있습니다.
   10. 상위 10% 밀도 구배 매체 경계(0%와 10% 밀도 구배 매체 층 사이의 계면)에서 형성된 밴드에서 기생충(메타고리 프로마스티고트 형태로 풍부함)을 수집합니다.
   11. 기생충을 1부피의 DMEM으로 희석하고 원심분리(실온에서 10분 동안 1,900 x g)로 수집합니다.
   12. 500 μL DMEM 배지에 재현탁하고 혈구계에서 계수하여 수율을 정량화합니다.
2. 축축(axenic) 배양 조건(낮은 pH / 고온)에서 L. amazonensis amastigotes 생성
   1. 25cm 2 플라스크(총 10mL 배지)를 사용하여 5mL의 log-phase promastigote 배양액(pH 7.4, 26 ^oC)과 동일한 부피의 amastigote 배지(pH 4.5)를 혼합하고 26°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 플라스크를 26°C에서 32°C로 이동합니다.
   3. 3 일 또는 4 일 후, 32 ° C에서 amastigote 배지에서 배양을 1 : 5로 분할합니다.
   4. 앞으로 3-4일(최대 7일) 이내에 기생충을 검사하여 감염에 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오.
      메모: 건강한 axenic amastigotes는 눈에 보이는 편모가 없는 타원형 모양을 가져야 합니다. 부분적으로 분화된 아마스티고테스는 짧은 편모가 있는 큰 타원형 모양을 가지고 있습니다. 배양에는 많은 덩어리가 있어서는 안 됩니다 - 많은 덩어리는 성장하지 않고 죽어가는 기생충의 징후입니다. 아마스티고테 배양은 1:5로 분할할 수 있으며 최대 3주 동안 유지할 수 있습니다.

4. L. amazonensis 감염

1. 원하는 감염 다중성(MOI)에 따라 기생충 현탁액을 희석합니다(일반적으로 대식세포당 3-5개의 메타고리클릭 프로마스티고트[MOI 1:3 또는 1:5] 및 대식세포당 1개의 아마스티고트[MOI 1:1]). 이미 2mL 배지를 함유한 각 웰에 50 - 100 μL의 부피로 PBS -/-에 Leishmania를 추가합니다.
2. 감염을 위해 34 ^oC에서 amastigotes로 1 시간, metacyclic promastigotes로 3 시간 동안 BMM을 배양합니다.
   메모: 최적의 감염 온도는 종에 따라 다를 수 있습니다.
3. 배양 후 37°C로 예열된 2mL PBS -/-로 각 웰의 유리 기생충을 3x로 철저히 씻어냅니다.
   메모: 커버슬립이 서로 떠오르지 않도록 PBS를 부드럽게 분산시킵니다. 플레이트를 부드럽게 휘젓고 액체를 흡입합니다. 교차 오염을 피하기 위해 여러 종류의 기생충을 사용하는 경우 별도의 흡인 팁을 사용하십시오.
4. 각 웰을 PBS -/-에 1.5 - 2mL의 2% PFA로 10분 동안 배양하여 1시간 또는 3시간 시점 샘플을 고정합니다. PBS -/-로 3회 세척합니다. 마지막 세척 및 오염될 때까지 PBS의 커버슬립이 들어 있는 플레이트를 흡인하지 마십시오.
5. 추가 시간 포인트를 위해 플레이트의 각 웰에 2mL의 새로운 BMM 배지를 추가하고 34°C에서 배양합니다.
6. 4.3단계에서 설명한 대로 남은 시간 지점을 원하는 대로 고정하고 얼룩이 질 때까지 플레이트를 냉장 보관합니다.

5. 4",6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 염색 및 커버슬립 장착

1. 커버슬립이 포함된 웰에서 PBS를 흡입하고 0.1% 비이온 세제와 함께 1.5mL PBS -/-를 추가합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 2mL PBS -/-로 3회 세척합니다.
2. 커버슬립이 포함된 웰에 2μg/mL DAPI(5mg/mL 원액에서 희석)가 포함된 1mL PBS -/-를 추가하고 실온에서 1시간 더 배양합니다.
   메모: DAPI를 사용한 잠복 시간은 세포 내 리슈마니아 기생충의 적절한 시각화에 매우 중요합니다. 대식세포 핵은 크기가 더 크고 디옥시리보핵산(DNA) 함량이 높기 때문에 빠르게 염색되지만 세포 내 기생충의 핵 염색은 더 느립니다. 따라서 DAPI가 기생충 원형질막과 기생충 핵막을 통해 침투할 수 있도록 BMM 핵을 시각화하는 데 필요한 것 이상으로 배양 시간을 연장해야 합니다. 적절한 DAPI 염색을 사용하면 핵 DNA 외에도 기생충의 편모 주머니 근처에 있는 미토콘드리아 키네토플라스트 DNA를 시각화할 수 있습니다.
3. 커버슬립이 포함된 각 웰을 2mL PBS -/-로 3회 세척한 다음 집게로 커버슬립을 들어 올리고 뒤집어 세포 면을 아래로 놓고 시중에서 판매되는 퇴색 방지 장착 시약으로 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
   메모: 커버슬립은 매우 약하므로 조심스럽게 다루어야 합니다. 특히 들어 올릴 때 우물의 측벽에 압력을 가하지 마십시오. PBS -/-를 몇 방울 추가하면 커버슬립과 웰 사이의 표면 장력이 감소하고 리프팅 과정이 용이해집니다. 우물 바닥에서 커버 슬립을 들어 올리는 데 도움이 되도록 미세 게이지 바늘을 사용할 수 있습니다. 슬라이드에 커버슬립을 놓은 후 집게로 부드럽게 눌러 장착 매체의 기포를 밀어냅니다. 들어올리는 과정에서 커버슬립이 파손되거나 뒤집혔을 가능성이 있는 경우 다시 장착하지 마십시오. 여분의 네 번째 커버슬립을 사용하기만 하면 됩니다.
4. 정량화가 이루어질 때까지 슬라이드를 냉장 보관하십시오.

6. 감염 정량화

1. 이멀젼 오일이 포함된 100X 대물 렌즈를 사용하여 대식세포에 초점을 맞춰 형광 현미경으로 DAPI 염색 슬라이드를 검사합니다(358nm에서 여기, 461nm에서 최적 방출).
   초점이 유리 슬라이드와 커버슬립 사이의 대식세포 층에 있는지 확인하십시오.
2. 수동 카운터를 사용하여 각 시야에 대해 대식세포(DAPI로 염색된 큰 핵)의 수와 각 대식세포 핵 주위에 모여 있는 작은 아마스티고트 핵(그림 1A, DAPI 참조)의 수를 정량화합니다.
   메모: Amastigote 핵은 크기가 작기 때문에 하나의 초점면에서 모두 보이지 않을 수 있습니다. 대식세포 핵에 초점을 맞출 때 보이는 기생충 수를 세고, 미세한 초점을 사용하여 대식세포 핵 위와 아래의 평면에 기생충 핵이 있는지 확인합니다.
3. 다른 시야로 이동하여 수량화를 반복합니다. 별도의 카운터 키를 사용하여 계산된 필드 수를 추적합니다. 계산이 겹치지 않도록 각 커버슬립을 가로질러 평행 행의 시야를 이동합니다.
4. 커버슬립당 최소 200개의 대식세포를 정량화합니다. 감염의 각 시점을 3회(커버슬립 3개)로 정량화합니다. 이전 커버슬립 중 하나가 커버슬립 겹침, 장착 불량, 유리 파손 등으로 인해 계산에 적합하지 않은 경우 네 번째 커버슬립을 계산합니다.
   메모: 하나의 커버슬립에 200개의 대식세포를 셀 수 없다면, 여분의 네 번째 대식세포를 세어야 한다.
5. 감염률을 amastigotes/macrophage 또는 amastigotes/100 macrophage로 계산하고 원시 정량화 데이터에서 감염된 대식세포 비율을 결정합니다.

결과

그림 1: L. amazonensis의 악성 axenic amastigotes(A) 및 non-virulent log-phase promastigotes(B)를 사용한 BMM 감염의 대표적인 그림.BALB/c 마우스에서 분리된 대식세포의 면역형광 이미지, 감염 후 1시간 및 48시간. 감염된 대식세포는 프로토콜에 기술된 대로 면역형광을 처리하였다. PV 멤브레인을 1시간 동안 rat anti-mouse Lamp1 단일클론 항체(1:1,000 희석)로 염색한 후 anti-rabbit 형광 IgG(1:500 희석)로 1시간 배양했습니다. 기생충 염색은 axenic L. amazonensis amastigotes에 대해 생성된 마우스 다클론 항체로 커버슬립을 배양한 후 항-마우...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 세포 배양 플레이트	(주)셀스타	657160
아데닌	아크로스 오가닉스	AC147440250
에어로졸 배리어 피펫 팁(100-1000 μL)	피셔브랜드	02-707-404
에어로졸 배리어 피펫 팁(20-200 μL)	피셔브랜드	02-707-430
에어로졸 배리어 피펫 팁(2-20 μL)	피셔브랜드	02-707-432
Bard-Parker 립백 탄소강 수술용 블레이드 #10	아스펜 서지컬	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL 주사기	벡턴 디킨슨(BD)	309604
BD 프리시전글라이드 니들, 25G	벡턴 디킨슨(BD)	305124
세포 배양 접시 35mm x 10mm	(주)셀스타	627 160
세포 배양 플라스크	(주)셀스타	660175
커버 안경 : 12mm 서클	피셔브랜드	제12-545-80
DAPI (4', 6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)	인비트로젠	D1306 (영어
D-비오틴	J.T. 베이커	C272-00
에디타	시그마 알드리치	EDS (에디에스)
에틸 알코올 200 프루프	팜코-AAPER	111000200
Falcon 100mm x 15mm 비 TC 처리 폴리스티렌 페트리 접시	코 닝	351029
소 태아 세럼	세라딤	1500-500
파이콜400	시그마 알드리치	F8016
형광 현미경	니콘	200회
염소 안티 마우스 IgG 텍사스 레드	인비트로젠	T-862
염소 안티 토끼 IgG AlexaFluor488	인비트로젠	A-11034
헤민	도쿄 화학 공업 주식회사	H0008
헤페스 (1M)	지브코	제15630-080
Isoton II 희석제	벡크만 쿨터	8546719
L-글루타민	쌍둥이자리	400-106
중간 199 (10X)	지브코	제11825-015
Na 피루브산 (100 mM)	지브코	제11360-070
파라포름알데히드	알파 에자르	43368
페니실린/스트렙토마이신	쌍둥이자리	400-109
인산염 완충 식염수 (-/-)	써모피셔	14200166
폴리프로필라인 원뿔형 원심분리기 튜브 15 mL	(주)셀스타	188 271
폴리프로필라인 원뿔형 원심분리기 튜브 50 mL	(주)셀스타	227 261
ProLong Gold 퇴색 방지 시약	써모피셔	P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 항체	발달 연구 Hybridoma Bank	1D4B
재조합 인간 M-CSF	페프로텍	300-25
Reichert Bright-Line 혈구계	Hausser 사이언티픽	1492
RPMI 미디엄 1640 (1X)	지브코	11875-093
트리톤 X-100 계면활성제	밀리포어 시그마	TX1568-1
트리판 블루	시그마 알드리치	T8154
섬세한 가위, 4 1/2 "	폭스바겐	82027-582
집게 해부, 가는 팁	폭스바겐	82027-386
현미경 슬라이드	폭스바겐	제16004-368
Z1 Coulter 입자 계수기, 이중 임계값	벡크만 쿨터	6605699

호 ) (영문) 년 호 년 호 호 년 명 명 년 년 년 년 년 호