Establishing an Infection Model Through Infection Model Through Microinjection of Gastric Organoids with Pathogenic Bacteria(위 오가노이드와 병원성 세균의 미세주입을 통한 감염 모델 구축)

초록

출처: Bartfeld, S. et al. 감염성 질환 모델로서의 오가노이드: 인간 및 쥐 위 오가노이드의 배양 및 헬리코박터 파일로리의 미세주입. J. Vis. 특급.(2015).

이 동영상은 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 오가노이드 내강에 미세주입하여 위 오가노이드 감염 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 위 세포의 감염으로 인한 변화를 연구하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 오가노이드 배양의 통과

1. 1ml의 차가운 기저 배지를 우물의 기저 매트릭스에 추가합니다. 1ml 마이크로피펫을 사용하여 기저 매트릭스가 분해될 때까지 위아래로 격렬하게 피펫을 쏟아냅니다. 15ml 튜브에 옮깁니다. 얼음 위에 놓습니다.
2. 피펫에 오가노이드를 집어 넣고 위아래로 10회 격렬하게 피펫팅합니다. 오가노이드의 파괴는 눈으로 관찰할 수 있습니다.

2. 오가노이드 배양의 미세주입.

참고: 이 프로토콜은 오가노이드에 박테리아를 미세 주입하는 데 사용할 수 있습니다. 미세주사에 더 관대한 오가노이드로 주사를 시작하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 마우스 위 오가노이드는 표적화하기 쉬운 매우 큰 낭포성 오가노이드로 성장할 수 있습니다.

1. 재료 준비
   1. 제조업체의 권장 사항에 따라 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 두 개의 주사 바늘로 당깁니다. 마이크로피펫 풀러는 중간에 있는 유리 모세관을 가열하고 모세관을 두 부분으로 당겨 두 개의 유리 바늘을 생성합니다. 여러 개의 바늘을 뽑아 깨끗한 페트리 접시에 보관하는 것이 실용적입니다.
   2. 세균 감염을 허용하려면 최소 3번의 매체 변경(=1주일) 동안 모든 매체에서 항생제를 제거합니다. 이것은 지하 매트릭스에서 항생제를 희석시킵니다. 특정 항생제에 내성이 있는 박테리아 균주를 사용하는 경우 이 특정 항생제를 추가하여 오염 가능성을 최소화하십시오.
   3. 미세 주입을 위해 작업대를 준비합니다. 다양한 생물 안전성 수준에서 작업하기 위해 멸균 벤치 내부에 실체 현미경을 배치해야 할 수도 있습니다. 이 프로토콜에서는 멸균 벤치 내부의 실체 현미경 아래에서 생물 안전성 레벨 2 조건으로 H. pylori를 주입합니다.
   4. 표준 프로토콜에 따라 박테리아를 배양하십시오.
   5. 감염의 다양성(MOI)을 추정하려면 아래에 설명된 대로 박테리아 수와 오가노이드당 세포 수라는 두 가지 매개변수를 추정합니다. MOI는 예를 들어 숙주의 IL-8 mRNA 발현과 같은 결과와 상관관계가 있을 수 있습니다.
      1. 감염 용액의 박테리아 밀도를 계산하려면 먼저 표준 프로토콜에 따라 광학 밀도 및 집락 형성 단위(CFU)의 표준 곡선을 설정합니다. 550nm에서 0.1의 광학 밀도는 약 10^7CFU/ml를 생성해야 합니다.
      2. 오가노이드당 세포 수를 추정하려면 1웰의 오가노이드 수를 세십시오. 1.1-1.4단계에 설명된 대로 오가노이드를 중단합니다. 200 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한 후 효소 해리 용액 1ml를 넣고 재현탁합니다.
         1. 37°C에서 5-10분 동안 반복적으로 흔들면서 배양합니다.현미경으로 세포가 단일 세포로 해리되었는지 확인합니다(10X 배율의 Leica DMIL과 같은 도립 현미경). 필요한 경우 배양을 연장하십시오.
         2. 혈구계를 사용하여 오가노이드당 세포 수를 계산하고 오가노이드당 세포 수를 계산합니다. 직경이 약 200μm인 인간 위 오가노이드에는 약 4,000개의 세포가 있습니다. ml당 1 x 10⁹ 박테리아가 있는 0.2 μl의 박테리아 용액을 주입하면 대략적인 MOI가 50입니다.
2. 오가노이드 주입.
   참고: 미세 주입의 경우 유리 바늘은 홀더에 고정되며 미세 조작기로 3차원으로 조작할 수 있습니다. 오가노이드는 우물 내의 지하 매트릭스 내에 남아 있습니다. 웰 안의 크기와 위치로 인해 모든 오가노이드가 동일하게 주입이 가능한 것은 아닙니다. 일반적으로 하나의 웰에서 가장 큰 30개의 오가노이드를 5분 안에 표적화할 수 있습니다.
   1. 박테리아를 수확하고 표준 프로토콜에 따라 기저 배지에서 세척합니다.
   2. 광학 밀도에 따라 ml당 박테리아 수를 계산합니다(2.1.5.1단계 참조). 기초 배지에서 박테리아를 ml당 1 x 10⁹ 박테리아로 희석합니다.
   3. 유리 바늘을 가져 가라. 집게를 사용하여 개구부 너비가 약 10μm가 되도록 팁을 끊습니다.
   4. 바늘을 주입 홀더에 삽입하고 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다.
   5. 바늘에 약 10μl의 세균 용액을 흡수합니다.
   6. 오가노이드 배양물을 포함하는 낮은 가장자리가 있는 4-well 플레이트를 실체현미경 아래에 놓습니다.
   7. 마이크로 매니퓰레이터로 탐색하면서 바늘로 단일 오가노이드를 목표로 합니다. 바늘을 오가노이드 가까이에 놓은 다음 한 번의 빠른 움직임으로 바늘을 오가노이드에 삽입합니다. 마이크로인젝터를 사용하여 각 오가노이드에 약 0.2μl의 박테리아 용액을 주입합니다.

3. 모든 분석을 위해 오가노이드를 수확합니다.

1. 예를 들어, 상등액을 제거하고 1ml 2% 포름알데히드를 첨가한 후 4°C에서 RT 또는 O/N에서 20분 동안 배양합니다. 오가노이드는 표준 절차에 따라 면역조직화학을 위해 처리할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
보통
헤페스	인비트로젠	제15630-056
고급 DMEM/F12	인비트로젠	제12634-028
마트리겔, GFR, 페놀 프리	BD (영어)	356231
글루타맥스	인비트로젠	제35050-079	재고 농도 200 mM, 최종 농도 2 mM
나27	인비트로젠	제17504-044	재고 농도 50 x, 최종 농도 1x
N-아세틸시스테인	시그마-알드리치	A9165-5G	재고 농도 500 mM, 최종 농도 1 mM
쥐 재조합 EGF	인비트로젠	PMG8043	재고 농도 500 μg/ml, 최종 농도 50 ng/ml
인간 재조합 FGF10	페프로텍	100-26	재고 농도 100 μg/ml, 최종 농도 200 ng/ml
핀셋	네올랩스	2-1033	끝이 가는 핀셋은 조직에서 근육층을 제거하는 데 도움이 됩니다.
4 웰 멀티디쉬	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	144444	다른 멀티 디쉬를 사용할 수 있습니다. 이들은 외부 테두리가 낮고 매니퓰레이터가 더 많이 움직일 수 있기 때문에 미세 주입에 특히 도움이 되었습니다.
마이크로인젝터	나리시게	메신저 - 5B
실체현미경	라이카	MZ75
마이크로피펫 풀러	셔터 기기	플레밍 브라운 마이크로피펫 풀러
Cag A 항체	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-25766