1. 녹색 형광 단백질, GFP 표지 Coxiella transposon 돌연변이 라이브러리의 생성
현지 규칙에 따라 미생물 안전 캐비닛(MSC)의 생물안전성 봉쇄 레벨 2(BSL-2)에서 Coxiella burnetii RSA439 NMII를 조작합니다. 사용된 박테리아 모델과 호환되는 경우 1.4.1에서 1.4.4까지 단계를 반복하여 클론 돌연변이를 얻을 확률을 높입니다. 전형적인 돌연변이 라이브러리는 (적어도) 사용된 유기체의 게놈에 주석이 달린 코딩 서열의 수의 3배와 동일한 수의 돌연변이로 구성됩니다.
- 전기 역량이 있는 Coxiella RSA439 NMII의 제조:
- 1x 산성화된 시트레이트 시스테인 매체-2(ACCM-2)를 준비합니다: 13.4mM 시트르산, 16.1mM 시트르산나트륨, 3.67mM 인산칼륨, 1mM 염화마그네슘, 0.02mM 염화칼슘, 0.01mM 황산철, 125.4mM 염화나트륨, 1.5mM L-시스테인, 0.1g/L 박토 네오펩톤, 2.5g/L 카사미노산, 1g/L 메틸 베타 사이클로덱스트린, 125ml/L 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI). pH를 4.75로 조정하고 필터 살균(오토클레이브 금지).
메모: 액체 ACCM-2는 4°C에서 약 1개월 동안 안정적입니다.
- -80°C 스톡에서 ACCM-2 100ml에 2 x 106 게놈 등가물(GE)/Coxiella RSA439 NMII(1.5단계에서 이전에 생성 및 정량화된 박테리아 스톡에서)를 접종하고 벤트 캡이 있는 75cm2 세포 배양 플라스크(플라스크당 10 - 15ml의 박테리아 현탁액)에 박테리아 현탁액을 분배합니다. 5 % 이산화탄소 (CO2 )와 2.5 % 산소 (O2 )의 가습 분위기에서 37 ° C에서 7 일 동안 성장합니다.
- 생성된 박테리아 현탁액을 50ml 튜브에 넣고 3,900 x g에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리기를 풀링합니다.
- 상등액을 버리고 펠릿을 10% 글리세롤 30ml에 재현탁합니다. 3,900 x g에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리기.
- 펠릿을 10% 글리세롤(일반적으로 2ml)의 적절한 부피로 재현탁시키고 500μl 튜브에서 50μl를 분취합니다. 전체 과정에서 얼음에 재현 된 박테리아를 유지하십시오 .
메모: 이 단계에서 박테리아는 전기 능력이 있으며 하나의 부분 표본으로 한 번의 전기천공을 수행하기에 충분합니다. 박테리아 현탁액은 -80°C에서 6개월 동안 보관하거나 플라스미드 디옥시리보핵산(DNA)의 전기천공에 직접 사용할 수 있습니다.
- 트랜스포손 및 트랜스포사제 인코딩 플라스미드를 사용한 유능한 Coxiella의 전기천공법:
- 0.1cm 전기천공(electroporation) 큐벳을 얼음 위에서 10분간 예열합니다. 50 μl의 전기 competent Coxiella와 10 μg의 transposon plasmid 및 10 μg의 transposase plasmid를 혼합합니다. 글리세롤의 희석을 최소화하기 위해 플라스미드 농도가 500μg/ml 이상인지 확인합니다.
- 다음 설정을 사용하여 전기천공: 18kV, 500 Ω, 25μF. 결과 시간 상수가 9에서 13msec 사이로 구성되는지 확인합니다.
- 즉시 950μl의 RPMI를 첨가하고 전기천공된 박테리아를 재현탁시킨 후 스크류 캡 튜브로 옮겨 실온에서 보관합니다.
- 전기천공된 박테리아 200μl를 취하고 1% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 ACCM-2 3ml를 6웰 플레이트에 추가합니다. 전기천공된 박테리아의 잔여 부피에 88μl의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 추가하고(10% DMSO의 최종 농도에 도달하기 위해) -80°C에서 보관합니다
참고: 다음 프로토콜의 경우, 전이 가능한 요소와 전이 효소는 두 개의 서로 다른 플라스미드(각각 pITR-CAT-GFP 및 pUC19-Himar1C9)에 의해 인코딩됩니다. 두 플라스미드 모두 Coxiella 특이적 복제 기원이 없기 때문에 Coxiella에서 전기천공될 때 자살 플라스미드가 됩니다. 이것은 안정된 transposon 삽입을 지킵니다. 전이 가능한 요소는 선택을 위한 Coxiella 프로모터 p1169의 조절에 따른 클로람페니콜 내성 카세트 및 생성된 돌연변이를 GFP로 라벨링하기 위한 Coxiella 프로모터 p311의 규제에 따른 GFP 유전자를 포함합니다.
- transposon 돌연변이체의 선택:
- 상기한 바와 같이 접종된 6-웰 플레이트(1.2.4)를 5%CO2 및 2.5%O2의 가습 분위기에서 37°C에서 밤새 배양합니다. 적절한 항생제(375μg/ml 카나마이신 또는 3μg/ml 클로람페니콜)를 추가합니다. 위에서 설명한 조건에서 추가로 3일 동안 박테리아 배양을 배양합니다.
- 개별 돌연변이의 분리:
- 고체 ACCM-2 플레이트의 준비 및 Coxiella transposon 돌연변이의 도금
메모: 다음 지침은 1 페트리 접시에 대한 것으로, 집락 분리를 위한 최적의 접종량을 평가하기 위해 박테리아 배양의 여러 희석을 테스트해야 합니다.
- 0.5% 아가로스 10.5ml를 전자레인지에 가열하고 55°C의 수조에서 식힙니다. 11.25 °C에서 2x ACCM-2 (pH 4.75) 37 ml를 가열합니다.
- 바닥 아가로스 준비:
- 용융된 0.5% 아가로스 10ml와 2x ACCM-2 10ml를 혼합하고 적절한 항생제(375μg/ml 카나마이신 또는 3μg/ml 클로람페니콜)를 첨가합니다.
- 페트리 접시에 즉시 붓습니다. 페트리 접시의 뚜껑을 덮지 않은 상태로 유지하고 매체를 30분 동안 식힌 다음 20분 동안 자연 건조합니다.
- 탑 아가로스 준비:
- 폴리스티렌 튜브 5ml에 2x ACCM-2 1.25ml와 물 0.75ml를 섞고 적절한 항생제(375μg/ml 카나마이신 또는 3μg/ml 클로람페니콜)를 첨가한 다음 37°C에서 배양합니다.
- 박테리아 배양액(일반적으로 1 - 100 μl)을 추가하고 5초 동안 와류를 추가합니다.
- 녹인 아가로스 0.5ml를 넣고 섞어 바로 바닥 아가로스에 붓습니다.
- 20분 동안 식힌 후 페트리 접시의 뚜껑을 닫고 4°C에서 20분 동안 배양하여 아가로스 응고를 촉진합니다.
- MSC에서 뚜껑을 덮지 않고 20분 동안 자연 건조합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 및 2.5 % O2의 가습 된 분위기에서 6-7 일 동안 플레이트를 성장시킵니다.
- 10% DMSO의 최종 농도에 도달하기 위해 나머지 박테리아 배양액에 DMSO를 추가하고 -80°C에서 보관합니다.
- 다음과 같이 최적의 희석을 평가합니다: 콜로니의 직경이 0.5-1mm이고 교차 오염을 방지하기 위해 적절하게 격리되어 있는지 확인합니다. 1.4.1.2 및 1.4.1.3에 설명된 대로 1.4.2 지점에서 나머지 박테리아 배양물을 해동하고 ACCM-2 한천에서 적절한 희석으로 플레이트를 만듭니다. 1.4.1.3.5에 설명된 대로 6-7일 동안 배양합니다.
- 콜로니가 검출되면 1ml 팁의 끝을 자르고, 분리된 콜로니가 들어 있는 플러그를 뽑고, 24웰 플레이트에 적절한 항생제(375μg/ml 카나마이신 또는 3μg/ml 클로람페니콜)가 함유된 ACCM-2 1.5ml를 피펫팅하여 콜로니를 분산시켜 콜로니를 수집합니다. 1.3.1에 설명된 조건에서 6일 동안 개별 군체를 증폭합니다. 배양 3일차에 각 배양액을 피펫팅하여 박테리아 덩어리를 분산시킵니다.
- 각 돌연변이 현탁액을 -80°C에서 10% DMSO의 96웰 플레이트에 있는 2D 바코드 스크류 캡 튜브에 보관합니다.
- 세균 농도 평가:
메모: 다음 프로토콜을 적용하여 축색 매질에서 복제되는 박테리아 돌연변이의 성장 곡선을 얻을 수 있습니다(1.4.4 참조).
- 표준 곡선 준비:
- 1x 트리스-에틸렌디아민테트라아세트산, EDTA(TE)에 이중 가닥 DNA(dsDNA)(일반적으로 알려진 크기 및 농도의 무작위 플라스미드)의 2μg/ml 원액을 준비합니다. 2μg/ml에서 2ng/ml 범위의 농도를 얻기 위해 원액에서 10배 연속 희석액을 준비합니다. 각 농도의 50μl를 검은색 벽과 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트의 단일 웰에 분배합니다(표 참조). Materials)를 참조하십시오.
- dsDNA 정량 시약을 1x TE buffer에 1:200으로 희석하고 96웰 마이크로플레이트의 각 샘플에 희석된 시약 55μl를 추가합니다. 플레이트 셰이커를 사용하여 잘 섞고 어두운 곳에서 실온에서 2-5분 동안 배양합니다.
- 형광 마이크로플레이트 리더와 표준 플루오레세인 파장(여기 ~480nm, 방출 ~520nm)에 대한 필터를 사용하여 샘플의 형광을 측정합니다.
- 형광 강도 판독값에 대한 플라스미드 농도 범위를 플로팅합니다.
- 박테리아 현탁액 정량화:
- 검은색 벽과 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트에 웰당 5μl의 10% Triton X-100을 분주합니다(재료 표 참조). 각 웰에 50μl의 박테리아 현탁액을 추가하고 플레이트 셰이커에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- dsDNA 정량 시약을 1x TE buffer에 1:200으로 희석하고 96웰 마이크로플레이트의 각 샘플에 희석된 시약 55μl를 추가합니다. 플레이트 셰이커를 사용하여 잘 섞고 어두운 곳에서 실온에서 2-5분 동안 배양합니다.
- 형광 마이크로플레이트 리더와 표준 플루오레세인 파장(여기 ~480nm, 방출 ~520nm)에 대한 필터를 사용하여 샘플의 형광을 측정합니다.
- 박테리아 DNA 농도를 얻으려면 1.5.1.4 지점에서 얻은 차트에 형광 판독값을 플로팅합니다. DNA 농도를 Coxiella 게놈의 질량(2.2 fg)으로 나누어 박테리아 농도를 구합니다. 결과를 Genome Equivalent/ml로 표현합니다.
- ACCM-2에서 심각한 성장 결함을 보이는 돌연변이를 폐기합니다.
2. 단일 프라이머 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR), 염기서열분석 및 주석
참고: 다음 프로토콜은 96개 샘플의 DNA 증폭을 위한 것이며, 다음 단계에는 다중 채널 피펫이 권장됩니다. 트랜스포손 특이적 프라이머(2.3)를 사용한 DNA 염기서열분석 및 마그네틱 비드를 사용한 PCR 산물의 컬럼 정제는 외부 회사에 하청을 주었습니다.
- 증폭 프라이머가 Coxiella 게놈의 트랜스포존 삽입 부위를 덮는 PCR 산물을 얻기 위해 ITR(Inverted Tandem Repeat)의 업스트림에서 100 및 200 염기쌍 사이를 혼성화하도록 설계되었는지 확인합니다. PCR 혼합물 3ml(고충실도 완충액 1개, 200μM 데옥시뉴클레오시드 삼인산(dNTP), 1μM 증폭 프라이머, 20U/ml 고충실도 DNA 중합효소)를 준비하고 얼음 위에 설정된 96웰 PCR 플레이트에 웰당 29μl를 분주합니다. ACCM-2의 고정상에 있는 각 돌연변이 1μl를 PCR 혼합물로 전달합니다.
- 초기 변성(98°C, 1분), 20개의 높은 엄격성 주기(98°C, 10초, 50°C, 30초, 72°C, 90초), 30개의 낮은 엄격성 주기(98°C, 10초, 30°C, 30초, 72°C, 90초) 및 30개의 높은 엄격성 주기(98°C, 10초; 50 °C, 30 초; 72°C, 90초) 후 72°C에서 7분 동안 최종 연장합니다.
- 마그네틱 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 트랜스포손 특이적 프라이머로 DNA를 염기서열화합니다. 50°C에서 75°C 사이로 구성된 예측된 용융 온도, 40%에서 60% 사이의 GC 함량, 18에서 25개의 뉴클레오티드 사이의 길이, 증폭 프라이머 혼성화 부위의 다운스트림 어닐링 사이트 및 트랜스포손 ITR의 첫 번째 염기쌍의 업스트림에서 최소 100개의 염기쌍으로 트랜스포손 특이적 프라이머를 설계합니다.
- 염기서열 분석 소프트웨어를 사용하여 Coxiella burnetii 493 NMI의 주석이 달린 완전한 게놈을 로드합니다. "reference to align" 기능을 사용하여 염기서열분석 결과를 로드 및 정렬(blastn)하고 전치 부위를 결정할 수 있습니다. 일치하지 않거나 이중 판독을 표시하는 돌연변이를 폐기합니다. 돌연변이 라이브러리의 포화를 모니터링하려면 동일한 사이트에서 여러 transposon insertion의 발생을 기록하십시오.
3. Coxiella 돌연변이를 이용한 진핵 세포 문제 및 세포 내 성장 모니터링
참고: 다음 단계에는 멀티채널 피펫이 권장됩니다. 감염은 검은색 벽과 평평하고 투명한 바닥이 있는 멸균 96웰 마이크로플레이트에서 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. GFP를 발현하는 wt Coxiella burnetii는 Robert Heinzen 박사가 제공했습니다.
- 항생제가 없는 상태에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 페놀이 적색이 없는 RPMI에서 Vero 세포를 성장시킵니다(완전한 RPMI 배지).
- 감염 전날, 합류 또는 하위 합류 세포 배양 플라스크에서 Vero 세포를 10ml의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
- 세포 배양 플라스크에 1ml의 트립신 EDTA 용액을 첨가하여 Vero 세포를 분리하고 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
- 10ml의 Complete RPMI 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 계수하고 ml당 105 세포의 세포 현탁액을 준비합니다.
- 바닥이 평평하고 투명한 검은색 96웰 플레이트의 각 웰에 100μl의 세포 현탁액을 분배합니다.
- 실온(RT)에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하여 웰 바닥에서 세포 접착을 촉진하고 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
- Coxiella 돌연변이가 포함된 96웰 플레이트를 RT에서 해동하고 딥 웰 96웰 플레이트에서 페놀 레드 및 FBS가 없는 RPMI 300μl에 150μl의 박테리아 현탁액을 희석합니다.
- Vero 세포가 포함된 마이크로플레이트에서 배지를 제거하고 100μl/웰의 희석된 Coxiella 돌연변이(MOI 100)를 분주합니다. well A1을 음성(비감염 세포) 대조군으로 사용하고 well A2 및 A3을 양성 대조군(100 및 200의 감염 다중성(MOI)에서 GFP를 발현하는 wt Coxiella에 감염된 세포)로 사용합니다.
- 에어로졸 밀폐 원심분리기 플레이트 홀더를 사용하여 상온에서 400 x g로 10분 동안 플레이트를 원심분리합니다.
- 37 ° C에서 5 % CO2의 가습 된 분위기에서 2 시간 동안 배양 한 다음 박테리아 함유 배지를 100 μl / well의 신선하고 완전한 RPMI 배지로 교체하십시오.
- 형광 마이크로플레이트 리더와 표준 플루오레세인 파장(여기 ~480nm, 방출 ~520nm)에 대한 필터를 사용하여 7일 동안 매일 GFP 형광을 측정합니다. 배양 배지의 응축 및 신호 분산으로 인한 간섭을 방지하려면 마이크로플레이트 리더에서 바닥 여기 및 방출 기록을 사용하십시오.
4. 자동 이미지 획득을 위한 샘플 준비
참고: 이 절차는 하나의 96웰 플레이트에 대한 것이며 그에 따라 부피를 확장하십시오. 4.2의 단계에서는 플레이트 와셔를 활용할 수 있습니다.
- 감염 후 7일째에 플레이트에서 배지를 제거하고 적절한 희석(일반적으로 1:1,000, 사용된 세포주에 따라 최적화됨)에서 세포 투과성 형광 염료를 포함하는 50μl/웰의 신선하고 완전한 배지로 교체합니다. 5% CO2의 가습 분위기에서 37 °C에서 30 - 60분 동안 세포를 배양합니다.
- 배지를 PBS에서 50μl/well의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 교체하고 실온(RT)에서 30분 동안 배양한 다음 PFA 함유 버퍼를 제거하고 PBS로 3회 세척합니다.
- PBS를 제거하고 0.05% 사포닌이 보충된 차단 용액(0.5% 소 혈청 알부민, 50mM 염화암모늄, PBS의 NH4Cl, pH 7.4)을 50μl/웰로 분배합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 차단 용액을 사포닌(위와 같이)이 보충된 40μl/웰의 새로운 차단 용액과 1:500 희석으로 항-리소좀 관련 막 당단백질-1(anti-LAMP1) 항체로 교체합니다. RT에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 차단 용액을 제거하고 96웰 플레이트를 100μl/웰의 PBS로 5회 세척합니다.
- 사포닌(위와 같이)이 보충된 40μl/웰의 차단 용액과 적절한 형광 표지된 2차 항체(1:1,000 희석)를 분배하여 4.4단계에서 적용된 anti-LAMP1 항체를 나타내고 5μg/ml에서 Hoechst 33258을 사용합니다.RT에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 차단 용액을 제거하고 96웰 플레이트를 100μl/웰의 PBS로 5회 세척합니다. 고정된 세포가 건조되지 않아야 하므로 96웰 플레이트의 마지막 세척에 해당하는 PBS의 부피를 그대로 두십시오.
- 후속 분석을 위해 즉시 플레이트를 이미지화하거나 빛으로부터 보호된 4°C에 플레이트를 보관하십시오.
5. 이미지 획득
- 20X 대물렌즈가 장착된 상형광 자동 현미경을 사용하여 GFP(488nm, 박테리아), Hoechst 33258(350nm, 숙주 세포 핵), 적색(~555nm, 세포막 마커) 및 근적외선(~615nm, LAMP1) 채널에서 이미지를 획득합니다. 샘플당 최소 5,000개의 세포를 이미지화하기 위해 웰당 21개의 독립적인 필드를 획득합니다. 숙주 세포 핵 채널을 기준으로 자동 초점을 적용합니다. 적은 비율의 숙주 세포를 감염시키는 박테리아 병원체로 작업할 때 사용자는 분석할 최소 500개의 감염된 세포를 얻기 위해 웰당 이미징된 독립 필드의 수를 조정할 수 있습니다.
