다음 프로토콜은 혐기성 종인 P. gingivalis의 침입을 배양하고 연구하는 방법을 설명합니다. 그러나 이러한 프로토콜은 여러 혐기성 병원체에 사용될 수 있습니다. HUVEC이 사용되지만, 이 프로토콜은 면역 및 비면역 모두의 다른 진핵 세포에 사용될 수 있습니다.
1. 혐기성 챔버 사용 및 유지 보수
참고: P. gingivalis는 주변 공기에서 발생하는 정상 수준의 산소에 민감한 혐기성 식물입니다. 통제된 혐기성 환경은 P. gingivalis의 재배에 필수적입니다.
- 여기서, 비닐 혐기성 챔버에서 혼합 혐기성 가스(80%N2, 10%H2, 10%CO2)로 지정된 인공 대기를 유지한다(그림 1A). 에어록(그림 1B)을 사용하여 실험실 환경에서 혐기성 챔버로 항목을 옮깁니다. 에어 록은 수동으로 작동하며 혼합 된 혐기성 가스를 도입하기 전에 N2 가스로 두 번 퍼지합니다.
- 원치 않는 황화수소를 유지 보수가 필요 없이 제거하기 위해 황화수소 제거 컬럼(그림 1C)을 사용하십시오. 챔버 내에 제습기를 놓아 촉매에 의해 생성된 H2O를 제거하고 오염 확산을 촉진하는 에어로졸을 방지합니다.
메모: 황화수소는 많은 혐기성 박테리아의 자연 대사 부산물이며 축적은 박테리아에 독성이 있으며 전자 장치를 손상시키고 촉매의 수명을 단축시킬 수 있습니다.
- 팬 박스를 사용하여 수소가 있는 상태에서 산소를 제거하는 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 대기를 순환시킵니다(그림 1D).
참고: 재순환 대기(고효율 미립자 공기 또는 HEPA) 필터는 0.22μm 이상의 공기 중 오염 물질을 제거합니다.
- 혐기성 챔버 내부에 위치한 37°C 인큐베이터에서 혐기성 박테리아를 배양합니다. 혐기성 챔버 내부에서 작업할 때 표준 무균 기술을 사용하십시오.
2. 혐기성 세균의 제조
참고: P. gingivalis는 공기에 잘 견디며 호기성 조건에서 보관할 수 있지만 6% 이상의 산소 수준에서는 성장하지 않습니다. 혐기성 챔버는 P. gingivalis와 다른 혐기성 종의 적절한 배양을 위해 필요합니다(그림 1). 마이크로 혐기성 물질로 작업하기 전에 혐기성 챔버 사용에 대한 적절한 훈련과 교육이 필요합니다.
- 잔류 산소를 제거하기 위해 실험 전 최소 12시간 동안 모든 액체 매체와 플레이트를 혐기성 조건으로 평형을 이룹니다.
- P. gingivalis를 -80°C 냉동고에서 혐기성 챔버로 옮기고 해동시킵니다.
- 트립티카제 콩 혈액 한천 플레이트(5% 양 혈액을 함유한 TSA II)에 P. gingivalis를 줄무늬로 만듭니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 37°C에서 혐기성 인큐베이터에서 4-7일 동안 보관합니다.
- P. gingivalis를 3ml 뇌 심장 주입(BHI) 육수에 접종하고 헤민과 메나디온, 무균 루프를 사용하여 혐기성 및 까다로운 미생물의 분리 및 배양을 위한 농축된 비선택적 액체 매체를 주입합니다.
메모: 장기 보관을 위해 BHI에서 준비한 박테리아 배양액을 글리세롤 또는 DMSO(10-20% 최종 농도)와 혼합하고 -80°C 냉동고에 넣습니다.
- 1:10 희석을 만들고 박테리아가 중간 로그 단계까지 성장하도록 하여 P. gingivalis의 스타터 배양을 준비합니다.
참고: 박테리아 현탁액의 광학 밀도가 결정되고 검사할 각 균주에 대한 박테리아 농도가 조정됩니다. P. gingivalis의 경우, OD660에서 현탁액이 0.7이면 중간 로그 상과 ~7 x 108 cells/ml에 해당합니다. 위의 프로토콜에 설명된 성장 조건은 P. gingivalis에 특이적이며 다른 박테리아 균주에 맞게 조정해야 할 수 있습니다.
3. 내피 세포 배양
참고: 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 5% CO2의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함하는 기저 배지에서 풀링된 1차 HUVEC 및 배양을 구입하십시오.
- 2.5 x 10 15ml VEGF 매체의5셀/플라스크에서 T-75 플라스크에 HUVEC을 시드합니다.
메모: 4.0% 트리판 블루를 1:1 희석하여 생존력을 확인합니다. 막이 손상된 세포는 트리판 블루를 유지하고, 멤브레인이 손상되지 않은 건강한 세포는 쌍안 현미경으로 볼 때 흰색으로 보입니다. 100개의 세포를 세고 세포의 80% 이상이 생존 가능한지 확인합니다.
- 세포가 ~80% 포화도에 도달할 때까지 2일마다 배지를 예열된 신선한 VEGF 배지로 교체하십시오.
- 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다. 2ml 트립신-EDTA(0.25%)를 5분 동안 배양한 후 2ml 트립신 중화 용액을 투여하여 T75 플라스크에서 세포를 방출합니다.
- 50ml 원뿔형 튜브에 부유 HUVEC을 수집합니다. PBS로 T-75 플라스크에서 여분의 세포를 씻어내고 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 200 x g에서 10분 동안 원심분리기 셀.
- 상층액을 제거하고 10ml의 예열된 VEGF 배지에 세포 펠렛을 현탁합니다.
- 혈구계 또는 유사한 세포 계수 장치를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.
- 6-well 플레이트(400,000/well) 또는 커버슬립이 있는 12-well plate(50,000/well)에 추가할 세포 현탁액의 양을 계산합니다. HUVEC은 다음 날 실험할 준비가 됩니다.
4. 생존 분석 침입 / 상호 작용 (도금)
참고: 이 분석을 수행할 때 400,000 cells/well에 파종된 내피 세포의 6-well 플레이트 2개를 준비합니다. 하나의 플레이트는 숙주 세포에 부착되고 내재화된 박테리아를 평가하는 데 사용됩니다. 다른 플레이트는 세포 내 박테리아를 설명합니다. 6웰 플레이트를 사용하면 한 번의 실험에서 두 개의 샘플을 세 번 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에 대한 개요는 survival assay flowchart(생존 분석 순서도)를 참조하십시오(그림 2).
- 위에서 설명한 대로 혐기성 박테리아가 중간 통나무 성장(OD660 0.5-0.7)에 도달할 때까지 준비합니다(섹션 1 참조).
- 5,000 x g에서 10분 동안 박테리아를 원심분리기합니다.
참고: 원심분리기가 혐기성 챔버 밖에 있는 경우 단단히 밀봉된 15ml 튜브에 박테리아 샘플을 넣고 운반하고 산소 누출을 방지하기 위해 파라필름으로 캡을 감쌉니다.
- 펠릿화된 P. gingivalis를 챔버에 다시 넣고 상층액을 버립니다. PBS로 세척하고 VEGF 배지에 재현탁하기 전에 박테리아를 다시 펠릿화합니다. 중간 로그 단계(~7 x 10,8 cells/ml)에 해당하는 0.7의 OD660에서 테스트할 모든 박테리아 균주에 대한 현탁액을 준비합니다. 박테리아는 이제 감염될 준비가 되었습니다.
- HUVEC을 함유한 6-well plate를 조직 배양 incubator에서 혐기성 챔버로 옮깁니다. 매체를 제거하고 혐기성 PBS로 3회 세척합니다. 각 웰에 혐기성 VEGF 배지 2ml를 추가하고 플레이트를 혐기성 인큐베이터에서 37°C로 20분 동안 배치하여 감염 온도를 평형화합니다.
메모: 감염에 사용되는 박테리아가 균질하고 감염 시 오염되지 않도록 하기 위해 혈액 한천 플레이트에 박테리아를 플레이트 로 만듭니다.
- 숙주 세포를 100:1.
의 감염 다중도(MOI 박테리아: 숙주)로 박테리아로 감염시킵니다.
메모: HUVEC 세포 수는 감염 전 단일 웰에서 트리팬 배제 테스트를 수행하여 결정됩니다. 박테리아 세포 수는 광학 밀도(예: OD 0.5 = 5 x 108 cells/ml)를 통해 측정됩니다. 박테리아 농도는 HUBEC의 농도에 따라 적절한 MOI로 조정됩니다.
- 감염된 HUVEC이 있는 6웰 플레이트를 혐기성 인큐베이터에 넣고 박테리아가 30분 동안 숙주 세포와 상호 작용하도록 합니다.
- 혐기성 챔버 내부의 BHI (1.0 % w / v)에 사포닌을 준비하고 0.2 μm 필터를 통해 여과합니다.
- 부착 된 박테리아와 내재 된 박테리아의 생존.
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 배지를 흡인하고, 혐기성 PBS로 3회 세척하고, 여과된 1.0% 사포닌 2ml를 추가합니다(4.8단계에서 설명한 대로 준비). 숙주 세포 용해가 가능하도록 15분 동안 배양합니다.
- 세포 스크레이퍼로 각 웰의 바닥을 긁어냅니다. 각 웰에서 세포 혼합물을 수집하고 BHI를 1:1로 희석합니다.
- 샘플의 연속 희석을 진행합니다. 박테리아 종과 농도에 따라 연속 희석을 조정하십시오. 1:100 또는 1:1,000 희석으로 시작합니다.
- 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석액 200μl를 플레이트. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 37°C의 혐기성 인큐베이터에 넣습니다.
- 37°C에서 7일 동안 배양한 후 플레이트를 제거하고 라이트박스를 사용하여 콜로니 형성 단위(CFU)를 계수하여 수동으로 콜로니를 계수합니다.
메모: CFU가 열거됩니다. 더 많은 양의 CFU의 경우 이미지를 촬영할 수 있으며 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 CFU를 쉽게 계수할 수 있습니다.
