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>1. 박테리아를 숙주 세포로 내재화(형광 현미경
)
참고: P. gingivalis는 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester(BCECF-AM)로 표시됩니다. BCECF-AM은 비형광 멤브레인 투과성 염료입니다. 세포 내 에스테라제의 작용을 통해 플루오레세인 BCECF로의 전환은 세포 생존력을 나타낼 수 있습니다. P. gingivalis는 BCECF-AM 염료로 표지된 다음 진핵 세포를 감염시키는 데 사용됩니다. 감염 후 세포는 DAPI와 TRITC-팔로이딘으로 고정되고 라벨링됩니다. 진핵 세포핵을 염색하는 데 사용되는 DAPI 염색은 박테리아 세포핵도 표지하여 BCECF-AM을 대사적으로 절단할 수 없는 생존 불가능한 박테리아를 식별하기 위한 대책을 제공합니다. 숙주 세포는 빨간색 액틴 염료인 TRITC-phalloidin으로 강조 표시됩니다.
- 오토클레이브 커버슬립. 5 x 104 cells/well에서 내피 세포를 파종하기 전에 12-well plate에 coverslips를 무균으로 추가합니다. (실험 전날 준비)
- 위에서 설명한 대로 12웰 플레이트에서 18mm(#1.5 두께) 원형 커버슬립에 내피 세포를 준비합니다.
- 중간 로그 단계(OD660 = 0.5-0.7)까지 성장한 혐기성 박테리아를 준비합니다.
- 5,000 x g에서 원심분리하고 5-7 x 108 cells/ml에서 PBS의 펠릿을 현탁하여 혐기성 PBS로 박테리아 2x를 세척합니다.
- 20μl의 0.2mM BCECF-AM을 2ml의 박테리아 현탁액(5-7 x 10,8 cells/ml)에 2μM의 BCECF-AM의 최종 농도에 추가합니다.
- 37 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 조직 배양 인큐베이터에서 18mm(#1.5 두께)의 원형 커버슬립에 파종된 내피 세포가 있는 플레이트를 혐기성 챔버로 옮깁니다. PBS로 세척하고 혐기성 VEGF 매체로 교환합니다.
참고: 광학 현미경에서 HUVECs가 정상인지 확인합니다. HUVECS는 ~80% 농도여야 하며 형태는 제조업체와 비슷해야 합니다.
- 잔류 BCECF-AM 염료를 제거하기 위해 5,000 x g에서 10분 동안 박테리아 표지를 원심분리기로 표시합니다. 2ml 혐기성 VEGF 매체에 현탁합니다.
- MOI 100:1(박테리아: 숙주)로 표지된 박테리아로 숙주 세포를 감염시킵니다.
- 37°C의 혐기성 챔버에서 30분 동안 배양합니다.
- 감염 후 PBS로 세포를 세 번 세척하고 갓 준비한 4.0% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정합니다.
메모: 세포를 고정한 후 혐기성 챔버 외부에서 실험을 수행할 수 있습니다.
- PBS로 커버슬립을 세 번 세탁하십시오.
- 0.2% 트리톤 X-100 1ml를 10분 동안 첨가합니다.
- PBS로 커버슬립을 세 번 세탁하십시오.
- 50μl의 TRITC 팔로이딘(50μg/ml)을 커버슬립에 45분 동안 추가합니다.
- 커버슬립을 세 번 세척하고 12웰 플레이트에서 제거한 다음 DAPI가 포함된 소프트 세트 장착 매체가 있는 슬라이드에 놓습니다. 매니큐어로 측면을 밀봉하십시오 .
메모: 슬라이드는 어두운 곳에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 광표백을 방지하기 위해 빛 노출을 피하십시오.
- 컨포칼 현미경을 사용하여 슬라이드를 봅니다.
- 여기에서는 전동 XY 스테이지가 있는 AxioObserver(반전) 스탠드 주변에 구성된 34채널 스펙트럼 시스템(32채널 어레이 검출기 및 2면 PMT 검출기, 투과광 검출기)을 사용합니다. 이 시스템에는 청색 다이오드(405nm), 다중 라인 아르곤(458, 488, 514nm), 녹색 다이오드(561nm), 적색 HeNe(633nm) 및 440nm 펄스 레이저의 5가지 레이저가 있습니다. 형광 수명 이미징 시스템에 2개의 하이브리드 GaAsP 검출기(FRET-FLIM용)를 장착합니다.
- 여기 파장이 340-380nm 및 540-560nm인 이중 대역 필터와 각각 435-485nm 및 570-590nm의 방출 필터를 사용하여 단일 채널에서 DAPI 및 TRITC의 형광을 검출합니다. 여기 파장이 440-500nm인 필터와 510-590nm의 방출 필터를 사용하여 BCECF-AM에서 형광을 검출합니다.
메모: BCECF-AM에 대한 통제는 생존 가능한 박테리아의 적절한 라벨링을 보장하기 위해 연구 중인 모든 박테리아 균주에 대해 수행되어야 합니다. 먼저 생존 불가능한 박테리아가 DAPI 양성 및 BCECF 음성인지 확인합니다. 둘째, 살아있는 박테리아가 BCECF-AM을 플루오레세인 BCECF로 대사할 수 있는지 확인합니다. 최적의 라벨링을 위해 박테리아 또는 BCECF-AM 염료의 다양한 농도를 테스트해야 할 수 있습니다.