박테리아 병원체에 대한 Opsonophagocytic Killing Activity 평가

초록

출처: Paschall, A. V. et al., 세균성 병원체에 대한 면역학적 반응을 평가하기 위한 Opsonophagocytic Killing Assay.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 인간 호중구와 폐렴구균의 공동 배양을 사용한 체외 oponophagocytic killing assay를 보여줍니다. 항체와 보체 단백질은 박테리아의 옵슨화를 촉진하여 호중구가 박테리아를 인식하고 죽일 수 있도록 하여 성공적인 호중구 옵소노식세포 활성을 보여줍니다.

프로토콜

1. HL-60 세포의 배양, 분화 및 검증

1. 500mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI)와 L-글루타민 및 50mL 열 비활성화 소 태아 혈청으로 구성된 HL-60 세포 배양 배지를 준비합니다. HL-60 세포의 분화에 영향을 줄 수 있으므로 항생제를 추가하지 마십시오.
2. HL-60 세포의 증식/유지를 위해 37°C에서 75cm² 통풍 플라스크와 5% 이산화탄소(CO₂)에서 10mL의 HL-60 세포 배양 배지에 5 x 10⁶ 세포를 배양합니다. 최적의 세포 농도를 유지하기 위해 3-4일마다 세포를 계대에 세웁니다.
   메모: 세포 농도는 5 x 10⁶/mL를 초과해서는 안 됩니다.
3. HL60 배양 배지에서 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 포함된 약 1 x 10⁶ cells/mL를 1mL 극저온 튜브로 분주하여 HL-60 세포의 작업 재고를 생성합니다.
   메모: 작업 재고는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 마스터 스톡은 -120 °C에서 보관해야 합니다.
4. 옵소노식식틱 사멸 활성(OPKA) 전 3일 동안 멸균 필터로 덮인 75cm² 플라스크에서 37°C에서 0.6% N, N-디메틸포름아미드(DMF) 및 5% CO₂를 사용하여 HL-60 세포 배양 배지 15mL에서 1.5 x 10⁷ 세포를 배양하여 HL-60 세포를 구별합니다.
5. 확립된 유세포분석 프로토콜에 따라 생존능 및 세포 표면 마커를 테스트하여 HL-60 세포가 성공적으로 분화되었으며 OPKA 분석에 사용하기에 적합한지 검증합니다. 분화 후 HL-60 세포를 수확하고 약 1 x 10⁴ 세포를 CD71, CD35, annexin V 및 propidium iodide에 대한 형광 접합 항체/염색으로 염색합니다.
   메모: 분화된 세포는 확립된 검증 프로토콜을 통해 결정된 바와 같이 ≥65% 생존 가능, ≥55% CD35⁺ 및 ≤20% CD71⁺여야 합니다(그림 1).

2. OPKA 버퍼 및 시약 준비

1. 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 42.5mL와 Ca²⁺/Mg²⁺, 열 불활성화 소 태아 혈청 5mL, 0.1% 멸균 젤라틴 2.5mL를 혼합하여 50mL의 멸균 옵소니화 완충액 B(OBB)를 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 아기 토끼 보충제를 구하여 -80 °C에서 보관하십시오.
3. 박테리아 배양 플레이트(즉, 15 x 100mm² 5% 양의 혈액 한천 플레이트)를 확보하거나 준비합니다.

3. 박테리아 원료 시료 준비

1. 테스트할 박테리아 균주의 재고를 확보합니다.
   참고: 이 프로토콜에는 혈청형 3 연쇄상구균 폐렴균(WU2, Moon Nahm 박사가 아낌없이 제공)이 사용됩니다.
2. 37°C에서 약 2−4시간 동안 적절한 육수(즉, Todd-Hewitt 육수 + 0.5% 효모 추출물)에서 박테리아 균주를 성장시킵니다.
   메모: 배양물의 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도는 0.6에서 0.8 사이여야 합니다.
3. 6,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화하고 적절한 육수에 15% 글리세롤 10-30mL에 세포를 재현탁합니다. 박테리아 배양액(분취당 500μL)을 멸균 1.5mL 원심분리 튜브에 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
4. 37°C 수조에서 박테리아 스톡 한 바이알을 해동합니다. 박테리아 세포를 펠렛화하고 멸균 조건에서 500μL의 OBB에 재현탁합니다.
5. OBB에서 박테리아 스톡의 다양한 희석액을 준비합니다(즉, 희석 없음 10μL, 1:10 10μL, 1:100 10μL 등). 처리되지 않은 박테리아 스톡의 다양한 희석액을 사용하여 아래 설명된 대로 OPKA 분석(HL-60/보체 공동 배양을 포함한 섹션 4–6)을 수행합니다. 30 ° C (CO₂ 없음)에서 밤새 플레이트를 배양하십시오 .
   메모: 30 ° C의 온도는 WU2가 과잉 성장을 방지하기 위해 특정됩니다. 다른 균주/혈청형은 37°C에서 최적으로 성장할 수 있습니다.
6. HL-60 세포와 함께 배양된 처리되지 않은 박테리아 스톡의 각 희석에 대한 콜로니를 계산하고 보충합니다. 어떤 박테리아를 희석하면 최적의 가산 콜로니 수(HL-60 세포와 공동 배양된 처리되지 않은 박테리아의 경우 약 80-120 콜로니 형성 단위(CFU))를 얻을 수 있는지 확인합니다. 이 박테리아 스톡과 관련된 향후 OPKA에 대한 이러한 희석에 유의하십시오.

4. 세균 처리 및 배양

1. 3.3단계에서 준비한 박테리아 스톡 튜브 하나를 해동합니다. 박테리아를 펠렛화하고(2분 동안 6,000 x g) 3.6단계에서 결정한 대로 최적의 희석으로 OBB에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
2. 둥근 바닥 96웰 세포 배양 플레이트에 웰당 10μL의 재현탁 박테리아 희석을 피펫으로 만듭니다.
3. duplicate.
   의 각 실험 웰에 20μL의 적절한 항체 또는 약물 처리를 추가합니다. 참고: 이 프로토콜에서는 마우스에서 생성된 혈청형 특이적 항체가 치료 X로 추가되고, 혈청형 3 다당류 캡슐을 분해하는 것으로 알려진 배당체 가수분해효소가 치료 Y로 추가됩니다(그림 2). 대조군 웰의 경우 처리 웰에 사용되는 버퍼에 따라 1x PBS 또는 OBB를 사용합니다.
4. 샘플 플레이트를 실온에서 90시간 동안 약 1rpm으로 흔듭니다. 테스트 중인 처리의 최적 온도 또는 흔들림 조건에 따라 이러한 조건을 조정하십시오.

5. HL-60 세균 공동 배양

1. DMF로 처리하기 3일 전(단계 1.4 참조)에 DMF로 처리된 HL-60 분화 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 수확하여 HL-60 세포를 준비합니다. 세포를 펠렛화하고(500 x g, 3분) 상층액을 버리고 최소 10mL의 1x PBS로 세척합니다.
2. 세척된 세포를 펠렛화하고(500 x g, 3분) 상층액을 버리고 OBB에 세포를 재현탁합니다(1mL OBB로 시작하여 세포 계수 후 최종 농도 1 x 10⁷/mL로 조정).
3. 아기 토끼 보충제(멸균, 희석되지 않은 아기 토끼 혈청, 생후 3-4주)를 1:5 최종 부피로 추가합니다.
   메모: HL-60-complement 혼합물의 최종 농도는 1 x 10⁷/mL여야 합니다. 보체 의존성을 테스트하는 경우, 열 비활성화 보체가 있는 활성 HL-60 세포를 포함하는 두 번째 용액을 사용할 수 있습니다(보체는 >55°C의 수조에서 최소 30분 동안 배양하여 비활성화할 수 있음).
4. 1시간 박테리아 배양이 완료된 후(단계 4.4), 각 샘플(즉, 각 30μL 샘플 웰 10μL을 두 개의 새로운 웰로 나눕니다)을 두 그룹의 중복 웰로 나눕니다(즉, 피펫팅 오류를 설명하기 위해 원래 30μL 공동 배양 중 20μL만 사용): 한 세트는 HL-60-complement와 함께 공동 배양하고 다른 세트는 박테리아만 포함합니다. HL-60-complement mixture (step 5.3)의 50 μL를 wells의 각 실험 세트 (위임 + HL-60)에 추가합니다. 박테리아의 웰에만 50μL의 OBB를 단독으로 추가합니다(위임 -HL-60).
   메모: 이 예에서는 약 800개의 박테리아 CFU가 5 x 10⁵/50 μL HL-60 세포와의 초기 공동 배양에 사용됩니다. 이러한 감염 다중도가 최종 콜로니 수로 표시된 것처럼 너무 높거나 너무 낮으면 HL-60 세포 수와 반대로 초기 박테리아 희석을 조정합니다.
5. 96웰 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 흔듭니다(CO₂ 없음).

6. 샘플 도금 및 하룻밤 배양

1. 각 샘플의 부피가 최소 50μL가 되도록 OBB로 각 웰을 1:5로 희석합니다.
2. 각 시료의 50 μL를 박테리아 배양 플레이트의 지정된 영역에 직접 피펫팅하여 시료 사이에 적절한 간격을 확보합니다. 15 x 100 mm² 원형 한천 플레이트의 경우 약 4 개의 샘플을 하나의 플레이트에 피펫합니다.
3. 뚜껑을 덮고 실온에서 약 15분 동안 샘플을 건조시킵니다.
4. 30°C에서 밤새 플레이트와 배양을 뒤집습니다(CO₂ 없음). 또는 혐기성 항아리에 배양 플레이트를 넣어 무산소 상태가 박테리아 성장에 영향을 미치는지 테스트하거나 형태를 제어할 수 있습니다.
5. 하룻밤 배양 후 지정된 각 샘플 영역의 군체를 세십시오. 각 세트의 살아있는 세포 수를 HL-60 세포 공동 배양을 받지 않은 해당 대조군 및/또는 샘플과 비교하여 데이터를 분석합니다(100% 세포 생존율, 0% 세포 사멸을 나타냄).

결과

그림 1: 유세포분석을 통한 HL-60 세포 분화 검증.분화된 HL-60 세포를 1 x 10⁵ cells/mL PBS에서 수확, 세척 및 재현탁시켰습니다. 그런 다음 세포를 96-웰 플레이트에서 12개의 웰(100μL/웰)로 분주했습니다. 그런 다음 세포를 형광 접합 항-CD35, 항-CD71, 부속 V 및 프로피듐 요오드화물로 염색했습니다. 염색되지 않은 세포 또는 형광 접합 동형항체로 염색된 세포를 대조군으로 사용했습니다.

그림 2: 치료제 Y는 HL-...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Annexin V (APC 활용)	바이오레전드	640919
Anti-CD35, 사람(PE 접합)	바이오레전드	333405
Anti-CD71, 사람(PE 접합)	바이오레전드	334105
사용할 박테리아 균주(예: 폐렴구균, WU2)	Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)
혈액 한천 플레이트	Hardy 진단	답10
태아 클론 세럼	하이클론	SH30080.03
글리세롤	시그마	G9012-1L
HL-60 셀	증권 시세	CCL-240
IgG 동형 대조군(PE 접합)	바이오레전드	400907
N,N-디메틸포름아미드(DMF)	피셔 케미컬	유엔2265
프로피듐 요오드화물	시그마	P4864
L-글루타민을 함유한 RPMI 매체	코 닝	10-040-이력서

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