숙주 내피 세포에서 내재화된 포르피로모나스 진지발리스(Internalized Porphyromonas gingivalis) 평가

초록

출처: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오에서는 인간 내피 세포 내에서 Porphyromonas gingivalis의 생존을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 내재화된 Porphyromonas gingivalis의 생존 및 성장 측정은 혈액 한천 플레이트의 집락 수로 평가됩니다.

프로토콜

1. 내재화된 박테리아의 생존.

1. P. gingivalis, 혐기성 박테리아가 중간 통나무 성장(OD₆₆₀, 0.5-0.7)에 도달할 때까지 준비합니다.
2. 박테리아를 5,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
3. 펠릿화된 P. gingivalis를 챔버에 다시 넣고 상층액을 버립니다. PBS로 세척하고 VEGF 배지에 재현탁하기 전에 박테리아를 다시 펠릿화합니다. 중간 로그 단계(~7 x 10,⁸ cells/ml)에 해당하는 0.7의 OD₆₆₀에서 테스트할 모든 박테리아 균주에 대한 현탁액을 준비합니다. 박테리아는 이제 감염될 준비가 되었습니다.
4. HUVEC을 함유한 6-well plate를 조직 배양 incubator에서 혐기성 챔버로 옮깁니다. 매체를 제거하고 혐기성 PBS로 3회 세척합니다. 각 웰에 혐기성 VEGF 배지 2ml를 추가하고 플레이트를 혐기성 인큐베이터에 37°C에서 20분 동안 배치하여 감염 온도를 평형화합니다.
5. 숙주 세포를 100:1.
   의 감염 다중도(MOI 박테리아: 숙주)로 박테리아로 감염시킵니다. 메모: HUVEC 세포 수는 감염 전 단일 웰에서 트리팬 배제 테스트를 수행하여 결정됩니다. 박테리아 세포 수는 광학 밀도(예: OD 0.5 = 5 x 10⁸ cells/ml)를 통해 측정됩니다. 박테리아 농도는 HUBEC의 농도에 따라 적절한 MOI로 조정됩니다.
6. 감염된 HUVEC이 있는 6-well plate를 혐기성 인큐베이터에 넣고 박테리아가 30분 동안 숙주 세포와 상호 작용하도록 합니다.
7. 혐기성 챔버 내부의 BHI (1.0 % w / v)에 사포닌을 준비하고 0.2 μm 필터를 통해 여과합니다.
8. 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 혐기성 PBS로 3회 세척하고 항생제가 보충된 VEGF 배지 2ml(겐타마이신 300μg/ml 및 메트로니다졸 400μg/ml)를 추가합니다.
9. 1시간 동안 배양합니다.항생제가 원하는 박테리아 균주를 죽이는 데 100% 효과적인지 테스트하고 숙주 세포에 침투하지 않는지 확인하십시오.
10. 흡입 매체에 여과된 1.0% 사포닌 2ml를 추가합니다. 숙주 세포 용해가 가능하도록 15분 동안 배양합니다.
11. 세포 스크레이퍼로 각 웰의 바닥을 긁어냅니다. 각 웰에서 세포 혼합물을 수집하고 BHI를 1:1로 희석합니다.
12. 샘플의 연속 희석액(1:100, 1:1,000)을 준비합니다.
13. 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석액 200μl를 플레이트. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 혐기성 인큐베이터에 넣습니다.
14. 37°C에서 7일 동안 배양한 후 플레이트를 제거하고 CFU를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
비닐 혐기성 챔버 - 타입 B	Coy 실험실 제품		모델 2000 인큐베이터
TSA II 트립티카제 소이 한천 w/5% 양 피	BBL	221261
인간 배꼽 정맥 내피 세포 10 기증자 풀	LifeLine 기술	FC-0044
VascuLife VEGF 미디엄 컴플리트 키트	LifeLine 기술	LL-0003
트립킷(TrypKit)	수명선	LL-0013
사포닌	리델 드 하엔	16109
겐타마이신 설페이트 소금	시그마-알드리치	G-1264
메트로니다졸	시그마-알드리치	엠-3761