종양 특이적 항체의 In vivo 국소화를 평가하는 기법

초록

출처: Shivange, G., et al. 표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 마우스 종양 이종 이식 모델에서 종양 특이적 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 기술을 보여줍니다. 종양 형성을 위해 암세포를 마우스에 피하 주입하면 종양 특이적 수용체에 결합하는 형광 표지된 항체를 주입하여 이미징을 통해 항체 국소화를 생체 내에서 평가할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 항체의 발현 및 정제

1. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 유지
   1. 유리 또는 일회용의 delong Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 37°C에서 130rpm에서 5% CO₂로 진탕하는 시판되는 1x 글루타민 보충제가 보충된 FreeStyle CHO Media에서 CHO 세포를 성장시킵니다.
      메모: 교반을 증가시키고 흔들리는 조건에서 가스 전달을 개선하기 위해 통풍 캡이 있는 배플 플라스크를 사용하는 것이 좋습니다. 현저하게 감소된 항체 수율은 현탁액 배양의 제한된 교반으로 인해 일반 플라스크(non-baffled)에서 얻어졌습니다.
   2. >95%의 세포 생존율로 1-5 x 10⁶ cells/mL 사이의 세포 수를 유지합니다. 세포 수가 5 x 10⁶ cells/mL 이상으로 증가하면 세포를 분할합니다. CHO 세포가 0.2 x 10⁶ cells/mL 미만에 도달하지 않도록 하십시오.
2. CHO 세포의 transfection
   1. delong Erlenmeyer baffled flasks.
      에서 200mL의 배지(2 x 10,⁶ cells/mL)에서 CHO 세포를 성장시킵니다. 메모: 배플 플라스크에서 성장한 현탁 배양은 배플이 없는 플라스크에서 성장할 때보다 항상 더 높은 단백질 수율을 생성했습니다.
   2. 15mL 튜브에 CHO FreeStyle 배지 5mL를 취하고 VH 클론 DNA 50μg과 VL 클론 DNA 75μg을 추가합니다. 소용돌이가 잘 섞입니다.
   3. DNA 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      메모: 배양 시간이 길어지면 단백질 수율이 감소합니다.
   4. DNA 용액에 750 μL의 1 mg/mL 폴리에틸렌이민(PEI) 스톡을 첨가하고 30초 동안 혼합물을 공격적으로 와류로 배양합니다. 실온에서 추가로 5분 동안 배양합니다.
      메모: PEI는 신선하게 만들어져야 합니다. PEI의 여러 번의 동결-해동 주기는 전체 수율을 크게 감소시킵니다.
   5. DNA와 PEI의 전체 혼합물을 세포에 첨가하면서 플라스크를 수동으로 흔듭니다. 즉시 delong Erlenmeyer 당황한 플라스크를 37°C에서 130rpm으로 진탕한 세포로 배양합니다.
3. 표현식
   메모: 항체는 N-말단 말단에 조작된 분비 신호 펩타이드를 가지고 있어 항체가 배지로 분비되는 데 도움이 됩니다.
   1. transfection된 세포를 37°C에서 성장시키고 1일차에 130rpm으로 진탕합니다.
   2. 2일차에 100x 항응집제 2mL와 100x 항균 항진균 용액 2mL를 추가합니다. 플라스크를 더 낮은 온도(32-34°C)로 옮기고 130rpm으로 흔듭니다.
   3. 5일마다 10mL의 트립톤 N1 사료와 2mL의 100x 글루타민 보충제를 추가합니다.
   4. 트리판 블루 염색으로 세포 분취액을 염색한 후 혈구계를 사용하여 3일에 한 번씩 세포를 계속 계수합니다. 세포 생존율이 80% 이상으로 유지되는지 확인합니다.
   5. 10일 또는 11일째에 항체 정제를 위해 배지를 수확합니다. 3000 x g, 4 °C에서 40-60 분 동안 배양물을 회전 한 다음 0.22 μM 병 필터를 사용하여 투명 매체를 여과합니다.
4. 정화
   메모: 항체 정제는 연동 펌프를 사용하여 시판되는 Protein-A 컬럼(재료 표 참조)을 사용하여 수행됩니다.
   1. 2열 부피의 결합 완충액(pH 7.4에서 20mM 인산나트륨)으로 컬럼을 평형화합니다.
   2. 항체가 포함된 여과된 배지(1.3.5단계에서 획득)를 1mL/분의 유속으로 컬럼에 통과시킵니다.
   3. 결합 버퍼의 2열 부피로 컬럼을 세척합니다.
   4. 5mL 용출 완충액(pH 3.4에서 30mM 소듐 아세테이트)을 사용하여 항체를 500μL 분획으로 용리합니다.
   5. 분획당 10μL의 중화 완충액(pH 9에서 3M 아세트산 나트륨)을 추가하여 용출된 항체의 pH를 중화합니다
      메모: 분수 번호 3-6은 대부분의 항체를 포함합니다. 항체가 예상보다 늦은 분획에서 용리되는 경우를 대비하여 모든 분획을 유지하는 것이 좋습니다.
   6. 분광광도계를 사용하여 면역글로불린 G(IgG)에 대한 기본 프로토콜을 선택하여 정제된 항체의 농도를 측정합니다. 항체의 최종 농도는 분자량과 흡수 계수를 고려하여 mg/mL 단위로 구합니다.

2. 형광 라벨링

참고: 항체는 NHS 에스테르 반응기를 포함하는 적외선 염료로 표지되며, 이 그룹은 단백질에 결합되어 안정적인 접합체를 형성합니다. 이 반응은 pH에 민감하며 pH 8.5에서 가장 잘 작동합니다. 염료로 표지된 형광 접합체는 최대 774nm의 흡수와 최대 789nm의 방출을 나타냅니다. pH 8.5는 효과적인 접합의 핵심입니다.

1. 투석 카세트(0.1-0.5mL)를 사용하여 1L의 접합 완충액(pH 8.5에서 50mM 인산염 완충액)에 0.5mL의 항체를 투석합니다. 4시간 후 투석 카세트를 새 버퍼로 옮기고 밤새 투석합니다.
2. 500 μL.
   의 반응 부피에 항체 1 mg당 0.03 mg의 IRDye 800CW를 첨가하여 접합 반응을 설정합니다. 메모: IRDye 800CW는 10mg/mL의 농도로 DMSO에 용해됩니다.
3. 20 °C.
   에서 2시간 동안 라벨링 반응을 수행합니다. 메모: 시간을 2시간 이상으로 늘려도 라벨링이 개선되지 않습니다.
4. 1x PBS에 대한 광범위한 투석을 통해 라벨링된 접합체를 정제합니다.
5. 780nm에서 염료의 흡광도를 측정하고 280nm에서 단백질의 흡광도를 측정하여 라벨링 정도를 추정합니다. 280nm 신호에 대한 염료 기여도는 3%입니다.
6. 다음 공식을 사용하여 염료/단백질 비율을 계산합니다.
   
   여기서 0.03은 280nm에서 사용된 염료의 흡광도에 대한 보정 계수(780nm에서 흡광도의 3.0%와 동일)이고, εDye 및 εProtein은 각각 염료와 단백질(항체)에 대한 몰 흡광 계수입니다.
   참고 : 염료는 270,000 ^{M-1 cm-1}이고 ε단백질은 203,000 ^{M-1 cm-1} (일반적인 IgG의 경우)입니다. IgG 이외의 단백질은 매우 다른 몰 흡광 계수를 가질 수 있습니다. 관심 단백질에 대한 올바른 흡광 계수를 사용하는 것은 D/P 비율의 정확한 측정을 위해 필수적입니다.
7. 다음 공식을 사용하여 최종 단백질 농도를 계산합니다.
   
   메모: in vivo 연구를 진행하기 전에 항상 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 또는 유세포 분석을 사용하여 표지된 항체와 표지되지 않은 항체의 항원 결합 효능을 확인하십시오.

3. 마우스 이종 이식 연구

1. 주사를 위한 종양 세포의 준비
   1. FBS 10%와 페니실린-스트렙토마이신 1배가 보충된 RPMI-1640 배지에서 OVCAR-3 세포를 성장시킵니다.
   2. 주사 전날, 10mL의 완전한 배지/접시가 있는 새로운 100mm 배양 접시에 세포를 계대배양합니다. 0.5-1 x 10⁶ 셀/접시의 셀 번호를 사용합니다.
   3. 37 ° C 온도, 95 % 습도 및 5 % CO₂에서 20-24 시간 동안 배양물을 배양합니다.
   4. 주입 당일에는 배양 접시에서 성장 배지를 제거하십시오. Ca²⁺/Mg²⁺ free Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)로 세포층을 철저히 헹구어 트립신 작용을 방해할 수 있는 죽은 세포, 세포 파편 및 모든 미량의 혈청을 제거합니다.
   5. 각 접시에 1.0-1.5mL의 Trypsin-EDTA 용액을 추가하여 세포를 트립신화하고 접시를 사방으로 기울여 용액을 펴 놓은 다음 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
      메모: 도립 현미경으로 세포를 관찰하여 실제 트립신화 상태를 확인합니다. 트립신화가 진행되면 배양 접시 표면에서 분리되는 세포의 수가 줄어들고, 트립신화가 과도하면 세포 스트레스가 유발됩니다. 따라서 적절한 트립신화가 중요합니다.
   6. 트립신 작용을 중지하기 위해 각 접시에 1.0-1.5 mL의 완전 성장 배지를 첨가한 후, 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시킵니다.
      메모: 부드러운 피펫팅은 세포 건강을 유지하는 데 중요합니다.
   7. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 모으고 실온에서 5분 동안 250 x g로 회전합니다.
   8. 상층액을 제거한 후 세포 펠릿을 수집하고 펠릿을 1x DPBS에 다시 현탁시켜 세포를 세척합니다.
   9. 셀 현탁액을 250 x g의 저속으로 5분 동안 회전시킵니다.
   10. 500μL의 DPBS를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 셀을 다시 현탁시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
   11. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
       메모: 정확도를 높이려면 계산을 세 번 반복하고 평균을 구하십시오.
   12. 최종 세포 밀도가 1 x 10⁸ cells/mL가 되도록 부피를 조정합니다.
2. 마우스 이종이식편을 개발하기 위한 세포의 피하주사
   메모: 모든 절차는 BSL2 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. Athymic Nude Foxn1^nu/Foxn¹⁺ 마우스가 현재 연구에 사용되었습니다.
   1. 50μL의 세포 현탁액을 1.5mL 튜브에 넣고 50μL의 기저막 매트릭스 배지와 혼합합니다.
      메모: 기저막 매트릭스 배지는 실온에서 젤과 같은 상태를 형성하는 경향이 있으므로 셀과 매트릭스 배지 혼합물을 얼음 위에서 조심스럽게 유지하십시오. 튜브, 팁 및 주사기는 냉장고에 보관한 다음 동물 주사 전에 얼음에 옮겨 넣는 것이 좋습니다.
   2. 세포가 뭉치지 않도록 혼합물을 교반합니다. 그런 다음 5 x 10⁶ 세포를 포함하는 이 100μL의 세포 현탁액-매트릭스 배지 혼합물을 1cc 주사기에 넣습니다.
   3. 동물의 피부를 부드럽게 들어 올려 기저 근육층에서 피부를 분리하고 26G 바늘로 피부 (5 x 10⁶ 세포) 아래의 세포 현탁액 (100 μL)을 천천히 주입합니다. 바늘을 꺼내기 전에 몇 초 동안 기다리면 기저 매트릭스 배지가 피부 아래의 세포와 함께 반고체 젤 같은 구조를 형성하여 주입 부위에서 혼합물이 나오는 것을 방지할 수 있습니다.
      메모: 면역 결핍 마우스에 해를 끼칠 수 있는 오염이 있는지 주입하기 전에 세포를 테스트해야 합니다. 주사하는 동안 바늘을 피부에 너무 깊숙이 넣으면 종양이 예상보다 깊게 형성될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
   4. 동물을 멸균 케이지에 보관하고 약 20분 동안 관찰합니다.
   5. 2-3 주 동안 마우스를 관찰하고 종양이 500mm³ 크기까지 자랄 수 있도록합니다.

4. in vivo imaging system을 사용한 항체 국소화

참고: 이 실험에 사용된 생체 내 이미징 장비(재료 표 참조)는 고효율 필터 및 스펙트럼 불혼합 알고리즘을 사용하여 살아있는 유기체 내의 세포 및 유전 활동을 실시간으로 비침습적으로 시각화하고 추적합니다. 이 시스템은 형광 및 생물 발광 모니터링 기능을 모두 제공합니다.

1. 꼬리 정맥을 통해 염료 표지 항체 25μg을 주입합니다.
   1. 종양이 있는 마우스를 2% 이소플루란을 사용하여 마취합니다. 페달 반사 신경에 대한 반응이 부족한지 확인하십시오.
   2. 생쥐가 움직임을 멈추면 지렁이 물을 뿌려 측면 꼬리 정맥을 확장시킵니다.
   3. 25 cc 인슐린 주사기와 26 G 바늘을 사용하여 1 cc 인슐린 주사기를 사용하여 표지된 항체 25 μg(100 μL 내)을 주입합니다.
   4. 마찬가지로, 음성 대조군으로, 암세포를 표적으로 하지 않는 비특이적 IgG1 Isotype 항체를 라벨링하고 주입합니다.
2. 항체 주사 8시간, 24시간, 48시간 후 생체 내 라이브 이미징을 수행합니다.
   1. 관련 소프트웨어에서 제어판에 있는 초기화를 클릭하고 스테이지 온도가 37°C인지 확인합니다.
   2. 산소 공급 장치, 마취 시스템의 모든 펌프 및 마취실에 대한 이소플루란 가스 공급을 켜고 이소플루란 기화 밸브를 2%로 설정합니다.
   3. 생쥐를 마취실로 옮기고 생쥐가 완전히 마취될 때까지 기다립니다. 눈이 건조해지지 않도록 눈 윤활 연고를 바르십시오.
   4. Control panel(제어판)로 이동하여 Imaging Wizard(이미징 마법사) 옵션을 통해 형광 이미징을 설정하고 773nm에서 여기(excitation)와 792nm에서 방출을 선택합니다.
      메모: 기본 자동 노출 설정은 좋은 형광 이미지를 제공합니다. 그러나 자동 노출 기본 설정은 필요에 따라 수정할 수 있습니다.
   5. 마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮기고 노즈 콘을 사용하여 이미징 필드에 조립합니다. 이미징 스테이지는 한 번에 5마리의 마우스를 수용할 수 있는 옵션을 제공합니다.
      메모: 테스트 마우스와 함께 대조군 마우스를 이미지화하여 분석하는 동안 유사한 양의 노출 및 기타 설정을 갖도록 합니다.
   6. 모든 것이 준비되면 이미지 획득을 위해 제어판에서 Acquire 옵션을 선택합니다.
   7. 자동 노출 설정을 사용하면 시스템이 1분 이내에 이미지를 생성합니다. 생성된 이미지는 광학 형광 강도가 카운트 또는 광자 단위 또는 효율 조건으로 표시되는 사진 이미지에 형광을 오버레이한 것입니다.
   8. 이미지를 획득한 후 이미징 챔버에서 마우스로 다시 옮기고 1-2분 동안 회복을 관찰합니다.
3. 이미지 분석을 위해 소프트웨어 내에 제공된 도구와 기능을 사용하여 이미지를 더욱 미세 조정할 수 있습니다. 이미지 분석 도구는 메뉴 모음과 도구 팔레트에 있습니다.
   1. 이미지 조정에서 밝기, 대비 또는 불투명도를 조정하고 색상 스케일을 선택합니다.
   2. ROI 도구를 사용하여 광학 이미지에서 관심 영역(ROI)을 지정하고 ROI 내의 신호 강도를 측정할 수 있습니다. 필요한 경우 정량화된 신호 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내고 데이터를 플로팅합니다.
   3. 후속 연구를 위해 다양한 조직(예: 간, 폐, 심장, 신장, 비장, 뇌 등)의 마우스 부검을 나란히 분석하여 형광 표지된 항체의 상세한 비특이적 분포를 확인합니다.
      메모: 데이터는 96 웰 어세이에서 항원(이 경우 FOLR1)을 사용하여 조직 특이적 ELISA로 추가로 뒷받침될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FreeStyle CHO 미디어	Gibco Life 기술	고양이 # 12651-014
안티 (100X)	Gibco Life 기술	고양이 # 15240-062
Anti-Clumping Agent (안티 응집제)	Gibco Life 기술	고양이 # 01-0057DG
BD 인슐린 주사기	BD 바이오사이언스	고양이 #329420
캘리퍼 IVIS 스펙트럼	퍼킨엘머	고양이 #124262
CHO CD 이피션트피드 B	Gibco Life 기술	고양이 #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)	코 닝	고양이 # 10-13-CV
코닝 500 mL RPMI 1640	코 닝	고양이 # 10-040-CV
Cy5 활용 항인간 IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	고양이 # 709-175-149
글루타맥스-I (100X)	Gibco Life 기술	고양이 # 35050-061
HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트	인비트로젠	고양이 # K21007
HiTrap MabSelect SuRe 컬럼	GE 헬스케어	고양이 # 11-0034-93
주입	다카라 바이오사이언스	344
IRDye 800CW NHS 에스테르	리코어	고양이 # 929-70020
이소플루란, USP	코브트러스	고양이 # 11695-6777-2
윤활제 눈 연고	Lacri-Lube 새로 고침	고양이 #4089
마트리겔	코 닝	고양이 # 354234
PEI 트랜스펙션 시약	써모 피셔	고양이 # BMS1003A
Slide-A-Lyzer 투석 카세트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	고양이 # 66333
Steritop 진공 필터	밀리포어 익스프레스	고양이 #S2GPT02RE
트립신-EDTA	Gibco Life 기술	고양이 # 15400-054
실험 모델: 세포주
인간: OVCAR-3	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	ATCC HTB-161
인간: CHO-K 세포	실험실에서 안정적으로 변화	ATCC CCL-61
마우스: 4T1	UVA의 Chip Landen 박사의 친절한 선물
마우스: MC38	UMBC Suzanne Ostrand-Rosenberg 박사의 친절한 선물	STR 프로파일링을 통해 인증됨
마우스: MC38 hFOLR1	우리 실험실에서 생성됨 (본 논문)
실험 모델: 동물
마우스 : athymic 누드 Foxn1nu / Foxn1 +	엔비고	여러 주문
마우스: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	잭슨 연구소	여러 주문

증권 시세 표시기) 시리즈