Mycobacterium tuberculosis Infected Macrophage Subpopulations의 유세포 분석 염색

초록

출처: Mily, A., et al. M1 및 M2 인간 단핵구 유래 세포의 분극 및 Mycobacterium tuberculosis 감염 시 유세포 분석을 사용한 분석. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 세포 생존율과 특정 형광 접합 항인간 항체 마커를 분석하기 위해 다중 색상 패널을 활용하는 유세포 분석 게이팅 전략을 보여줍니다. 이 접근 방식을 통해 Mycobacterium tuberculosis에 감염된 세포 집단의 비율을 정확하게 결정할 수 있습니다.

프로토콜

1. Mtb에 감염된 단핵구 유래 세포의 유세포 분석 염색

참고: 다음 단계는 BSL-3 시설에서 수행해야 합니다. 유세포 분석은 튜브 대신 96웰 플레이트에서 수행할 수 있습니다.

1. 37°C 및 5% CO₂에서 최소 30분 동안 웰당 1mL의 FACS 완충액으로 배양하여 6웰 플레이트의 웰에서 Mycobacterium tuberculosis, Mtb에 감염된 세포(및 감염되지 않은 대조군)를 분리합니다.
2. 세포가 분리되었는지 확인하기 위해 위아래로 몇 번 부드럽게 피펫팅합니다. 가능하면 현미경으로 세포 박리를 확인하십시오. 각 웰의 세포 현탁액을 나사로 덮인 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 200 x g에서 5분 동안 회전시킵니다. 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 폐기합니다.
3. FACS 버퍼로 각 튜브의 세포 펠릿을 두 번 세척하고 5분 동안 200 x g에서 세포를 회전시킵니다.
4. TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (표 1)을 포함한 형광 접합 항 인간 항체의 약 50 μL 칵테일로 세포를 염색합니다.
5. 염색된 세포를 400μL의 FACS 완충액으로 두 번 세척하고 200 x g에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다.
6. 염색된 세포를 200μL의 고정 완충액(새로 준비된)으로 암흑 속 RT에서 30분 동안 고정하여 마이코박테리아의 완전한 비활성화를 보장합니다.
7. 400μL의 FACS 버퍼로 셀을 두 번 세척하고 200 x g에서 5분 동안 회전하여 과도한 고정 버퍼를 제거합니다.
8. 400μL의 FACS 완충액에 고정된 세포를 재현탁하고 BSL-2의 유세포 분석을 위해 BSL-3 실험실에서 샘플을 꺼내기 전에 새로운 1mL 마이크로 원심분리 튜브로 샘플을 옮깁니다. 시료를 채취할 때까지 염색된 세포를 +4 °C에서 보관하십시오.
   메모: BSL-3 실험실에서 튜브를 꺼내기 전에 튜브에 70% 에탄올을 분사하십시오. 포름알데히드는 독성(발암성)이므로 2등급 생물 안전 캐비닛에서 처리해야 합니다. 포름알데히드 폐기물은 별도의 화학 폐기물에 버리십시오.

2. Mtb에 감염된 단핵구 유래 세포의 유세포 데이터 수집 및 분석

참고: 2.1–2.2단계는 위에서 설명한 유세포 분석 염색 전에 수행해야 합니다. 세포 고정 후 세포 응집 및 탠덤 염료의 해리 문제를 방지하기 위해 1차 항체 염색 후 4-10시간 이내에 Mtb에 감염된 세포와 감염되지 않은 세포 모두의 샘플 채취를 수행합니다.

1. 위에서 설명한 유세포 분석 염색 전에 보상 비드(positive 및 negative 모두)를 사용하여 염색 패널(표 1)에 나열된 각 형광 접합 항체에 대한 형광 신호를 보상합니다.
2. 인간 대식세포의 염색을 위한 항체 희석액을 적정하여 각 형광 색소에 대한 최적의 신호를 얻습니다.
3. 염색되지 않은 세포를 사용하여 염색된 세포를 시각화할 수 있도록 음성 세포 집단에 대한 게이트를 설정하는 데 필요한 배경 형광 수준을 결정합니다(대식세포는 고도의 자동 형광성입니다).
4. 데이터 수집에 권장되는 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석기에서 최소 50,000개의 세포/샘플을 획득합니다.
5. 유세포분석기에서 획득 파일을 유세포 분석 표준(FCS) 형식 3.1로 내보냅니다.
6. 유세포 분석 소프트웨어에서 FCS 파일을 분석합니다.
7. 대식세포는 전방 및 측면 산란(FSC 및 SSC) 특성에 따라 게이트를 제어하고 Zombie-UV 생존력 염료를 사용하여 살아있는/죽은 세포 게이팅을 통해 죽은 세포를 제외합니다.
8. FITC 채널에서 H37Rv-GFP에 감염된 대식세포를 시각화합니다.
9. 모든 마커에 대해 양성 염색된 세포의 빈도와 기하학적 평균 형광 강도(MFI)를 식별합니다(표 1).

표 1: 유세포 분석에 사용되는 항체 목록.

의 시리즈 의 년 의 의 의 의 의 표시기 의 년 의 의 (영어) 의

레이저	필터	형광 색소	표현형	기능	클론	카탈로그 번호	회사
639	30분의 670	AF647	TLR2	병원체 인식 수용체	TL2.1	309714	바이오레전드
639	60분의 780	APC-싸이7	CD206	만노스 수용체	15-2	321120	바이오레전드
405	20분의 610	BV605	CD163	청소부 수용체	기가/61	333616	바이오레전드
405	30분의 670	BV650	CD80	공동 자극 분자	2D10	305227	바이오레전드
405	50분의 710	BV711	CCR7	케모카인 수용체	G043H7	353228	바이오레전드
405	60분의 780	BV785	CD86	공동 자극 분자	IT2.2	305442	바이오레전드
488	530/30	일반품질보증(GFP)	증권 시세	세포 내 박테리아
561	586/15	체육	CD200R	억제성 수용체	옥스-108	329306	바이오레전드
561	14분의 620	체육/대즐 594	CD64	IgG의 Fc 감마 수용체-I	10.1	305032	바이오레전드
561	20분의 661	PE-Cy5 (PC5)	HLA-DR	MHC 클래스 II 분자	L243	307608	바이오레전드
355	50분의 450	부브395	생존력 염료	살아있는/죽은 세포 마커	좀비 UV	423108	인비트로젠

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포름알데히드	시그마-알드리치	F8775
염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 594 2차 항체	인비트로젠	R37121	CD64에 대한 2차 항체
염소 항토끼 IgG Alexa Fluor 594 2차 항체		A-11037	CD163에 대한 2차 항체
소 태아 혈청(FBS)	시그마-알드리치	F7524
EDTA (0.5 M)	카롤린스카 대학 병원, Huddinge	해당 사항 없음
BD 콤프 비드 플러스	BD (영어)	560497