사이토카인 유도 살해 세포의 세포독성 능력을 연구하기 위한 체외 분석

초록

출처: Hsiao, C. H., et al. 암 치료를 위한 세포독성 사이토카인 유도 킬러 T 세포의 분리 및 확장. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 암세포에 대한 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포의 세포독성 능력을 측정하는 체외 기술을 보여줍니다. 표적 암세포와 CIK 세포를 공동 배양하면 형광 생존도 염료를 사용하여 죽은 암세포를 식별하고 유세포 분석을 사용하여 정량화하여 CIK 세포의 세포독성 효과를 추정합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 재료 준비

1. 시약, 항체 및 화학 물질은 물질안전보건자료(MSDS)에 표시된 대로 보관하십시오. 약물 또는 사이토카인을 원액으로 용매에 용해시킨 다음 -20°C 또는 -80°C에서 보관하기 위해 분취합니다.
   메모: 재료 준비에 대한 자세한 정보는 재료 표에 나와 있습니다.

2. 말초혈액 단핵세포(PBMC) 분리

1. 사용하기 전에 밀도 구배 용액(재료 표)을 18–20°C로 가열하십시오. 철저한 혼합을 보장하기 위해 용액 병을 여러 번 뒤집습니다.
2. 헤파린화된 바이알에 3-5mL의 인간 정맥혈 샘플을 수집하고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 잘 섞습니다.
3. 15mL 멸균 튜브에 4mL의 밀도 구배 용액을 준비합니다.
4. 혈액 샘플 1mL를 밀도 구배 용액에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.
5. 400 x g에서 18−20 °C에서 30분 동안 원심분리기(브레이크 끄기).
6. 1mL 멸균 피펫을 사용하여 15mL 튜브의 층을 방해하지 않도록 단핵 세포(약 1mL)의 버피 코트 층을 한 번에 조심스럽게 즉시 흡인합니다.
7. 원심분리 튜브의 담황색 코팅에 최소 3부피(~3mL)의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가합니다. 멸균 피펫으로 세포를 위아래로 3회 이상 부드럽게 피펫팅하여 세포를 매달아 놓습니다.
8. 400 x g에서 18-20 °C에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 흡입합니다.
9. 세포 펠릿을 5mL의 기초 배지(Table of Materials)로 현탁하고 플라스크로 옮깁니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5%_CO2에서 세포를 배양합니다.

3. CIK 유도 및 확장

1. 0일차에 37°C 및 5% CO₂의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 1,000IU/mL의 IFN-γ를 포함하는 신선한 기저 배지에서 PBMC(1 x 10⁶)를 배양합니다.
2. 1일차에 항-CD3 항체 50ng/mL, 재조합 인간(rh) IL-1α 1ng/mL 및 rh IL-2 1,000U/mL를 함유한 새로운 기저 배지로 배지를 새로 고칩니다. 3일마다 매체를 새로 고칩니다.
3. 7일차에 1,000 U/mL의 rh IL-2를 함유한 새로운 기저 배지로 배지를 새로 고칩니다. 세포 확장이 끝날 때까지 3일마다 배지를 새로 고칩니다(14일차).

4. CIK 세포 평가를 위한 면역표현형 분석

1. CIK 세포를 10mL의 멸균 PBS로 세척합니다. 300 x g 및 18−20 °C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡인하고 10mL의 PBS로 세포를 재현탁합니다. trypan blue exclusion assay를 사용하여 세포 수와 세포 생존율을 계산합니다.
2. CIK 세포를 ~5–10 x 10⁵ cells/mL PBS의 밀도로 6개의 멸균 1.5mL 튜브로 분주합니다. 다음과 같이 라벨을 붙이고 처리하십시오 : 튜브 1, 블랭크 (항체 없음); 튜브 2, 20 μL의 동형 IgG1-FITC를 추가합니다. 튜브 3, 20 μL의 동형 IgG1-APC mAb를 추가합니다. 튜브 4, CD3-FITC의 20 μL를 추가합니다. 튜브 5, 20 μL의 CD56-APC mAb 추가; 및 튜브 6에 20μL의 CD3-FITC 및 20μL의 CD56-APC mAbs를 추가합니다.
3. 1mL 멸균 피펫으로 CIK 세포를 위아래로 3회 이상 부드럽게 피펫팅하여 항체와 부드럽게 혼합한 다음 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. 300 x g 및 18−20 °C에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.상등액을 흡입하고 PBS 1mL로 세포 펠렛을 한 번 현탁합니다. 1mL 멸균 피펫으로 최소 3회 위아래로 부드럽게 피펫을 주입합니다.
5. 4.4단계를 반복합니다.
6. 유세포 분석 전에 튜브를 어두운 곳에 두십시오.

5. CD 마커 인식

1. 캡을 통해 부드럽게 피펫팅하여 세포 여과기 캡(100μm 메쉬)이 있는 멸균 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다. 캐러셀에 튜브를 순서대로 놓습니다.
2. 유세포 분석 소프트웨어를 열고 실험 폴더를 만듭니다. New Specimen 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가하고 튜브 이름을 다음과 같이 지정합니다. 튜브 2, 동형 IgG1-CD3; 튜브 3, 동형 IgG1-CD56; 튜브 4, CD3; 튜브 5, CD56; 튜브 6, CD3CD56.
3. CIK 세포 집단에 대한 산란 게이팅 시스템을 만듭니다(그림 1A).
   1. Tube 1 (Blank)을 선택하고 도트 플롯 버튼을 클릭하여 FSC-A/SSC-A 플롯을 생성합니다. 세포 파편을 제외하기 위해 FSC-A 임계값 >5 x 10⁴로 전체 세포 집단에 대해 직사각형 게이트를 그립니다.
   2. 새 점도표에 대한 SSC-A/SSC-H 매개변수를 선택하고 모든 단일 셀 주위에 폴리곤 게이트를 그립니다. 새 히스토그램 플롯에 대해 Count/FITC(CD3) 및 Count/APC(CD56) 매개변수를 각각 선택합니다. 새 점도표에 대한 FITC(CD3)/APC(CD56) 매개변수를 선택하고 4개의 사분면 게이트를 그려 4개의 부분모집단을 정의합니다.
   3. 각 표본에 있는 20,000개의 단일 세포에서 데이터를 기록합니다. Load Sample 버튼을 클릭하여 Blank control 샘플을 먼저 분석합니다. CD56 및 CD3 채널 파라미터를 사용하여 전체 CIK 세포 집단을 식별합니다.
4. 모든 표본을 조사하기 위해 5.3단계를 반복합니다.
5. 개별 검체의 통계적 값이 포함된 파일을 열어 CIK 세포 집단을 분석하고 분석 파일로 다시 인쇄합니다.

6. 인간 만성 골수성 백혈병 K562 세포 및 난소암 OC-3 세포의 배양 및 염색

1. K562 셀
   1. 세포 배양 플라스크에서 0.5−1 x 106 cells/mL의 밀도로 완전한 배지(10% 소 태아 혈청[FBS] 및 50 U/mL 항생제를 함유하고 포도당을 4.5 g/L로 조절하는 RPMI 기저 배지)에서 K562 세포를 배양하고 37°C 및 5%_CO2의 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
   2. K562 세포가 포함된 배양 배지를 50mL 멸균 튜브로 옮기고 실험 당일 18-20°C에서 10분 동안 300 x g에서 세포를 펠렛
   화합니다.
   3. 상등액을 흡인하고 멸균 PBS 5mL에 세포를 재현탁시킨 후 부드럽게 잘 혼합합니다.
   4. 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 흡인하고 PBS에서 세포를 재현탁하며 K562 세포를 0.5-1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 조정합니다.
   5. 15mL 멸균 튜브의 K562 세포 현탁액 1mL에 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 염료 0.5μL를 최종 농도 5μM로 추가합니다. 최소 3회 위아래로 피펫팅하여 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
   6. 튜브를 37°C 및 5% CO₂의 세포 배양 인큐베이터에 10-15분 동안 그대로 둡니다.
   7. PBS 9mL를 튜브에 넣고 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다. 상등액을 디캔팅한 다음 세포 펠렛을 10mL의 완전한 배지에 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 세포 배양 플라스크로 옮기고 인큐베이터에 넣습니다.
2. OC-3 세포
   1. 37°C 및 5%_CO2의 세포 배양 플라스크에서 0.5–1 x 10⁶개의 세포를 포함하는 완전한 배지(10% FBS 및 50 U/mL 항생제를 함유하는 DMEM/F12 배지)에서 OC-3 세포를 배양합니다.
   2. 배양 배지를 흡인하고 실험 1일 전에 PBS로 세포를 세척합니다.
   3. 세포 해리 효소 용액 1mL(Table of Materials)를 추가하여 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
   4. PBS 5mL를 첨가하여 세포를 현탁시키고 부드럽게 잘 섞습니다. 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡인합니다. PBS에서 세포를 재현탁하고 세포를 0.5–1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 조정합니다.
   5. 15mL 멸균 튜브에 있는 OC-3 세포 현탁액 1mL에 CFSE 염료 0.5μL를 최종 농도 5μM로 추가합니다. 최소 3회 위아래로 피펫팅하여 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
   6. 튜브를 37°C 및 5% CO₂의 세포 배양 인큐베이터에 10-15분 동안 그대로 둡니다.
   7. PBS 9mL를 튜브에 넣고 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다.상층액을 디캔팅한 다음 완전한 배지로 세포 펠렛을 현탁합니다. 5 x 10⁵ cells/well을 6 well 플레이트에 파종하고 37°C 및 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.

7. 세포독성 분석

1. CIK와 K562 세포의 공동 배양(CIK-K562)
   1. 6.1.7단계에서 K562 세포를 계수하고 trypan blue exclusion assay로 세포 생존율을 테스트합니다. 6 well plate의 각 well에 5 x 10⁵/mL 밀도로 1mL의 K562 cell을 추가합니다.
   2. 다음과 같이 3.4단계에서 CIK 세포가 있거나 없는 1mL의 기저 배지를 7.1.1단계의 6웰 플레이트에 추가합니다: 웰 1 = 블랭크, K562 세포 단독(5 x 10⁵); 웰 2 = CFSE 염색 K562 세포 단독(5 x 10,⁵); 웰 3 = CIK 세포(E[effector], 25 x 10⁵) + CFSE 염색 K562 세포(T[target], 5 x 10⁵); 웰 4 = CIK 세포(E, 50 x 10⁵) + CFSE 염색 K562 세포(T, 5 x 10⁵).
   3. 세포 현탁액을 위아래로 3회 이상 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다.
2. CIK와 OC-3 세포의 공동 배양(CIK-OC-3)
   1. 다음과 같이 3.4단계에서 CIK 세포가 있거나 없는 1mL의 기저 배지를 6.2.7단계의 6웰 플레이트에 추가합니다: 웰 1 = 블랭크, OC-3 세포 단독(5 x 105); 웰 2 = CFSE 염색 OC-3 세포 단독(5 x 10,⁵); 웰 3 = CIK 세포 (E, 25 x 10⁵) + CFSE 염색 OC-3 세포 (T, 5 x 10⁵); 웰 4 = CIK 세포(E, 50 x 10⁵) + CFSE 염색 OC-3 세포(T, 5 x 10⁵).
   2. 세포 현탁액을 위아래로 3회 이상 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.
3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 염료 염색
   1. 7.1.3단계에서 CIK-K562 세포 현탁액을 15mL 멸균 튜브로 직접 채취합니다.
   2. 7.2.2단계에서 CIK-OC-3 그룹에서 현탁 세포와 부착 세포를 모두 수확합니다.
      1. 세포 현탁액을 15mL 멸균 튜브로 옮깁니다. 1mL의 멸균 PBS로 웰을 세척하고 PBS를 모아 튜브에 추가합니다. 세포 해리 효소 용액 0.5mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      2. 동일한 튜브의 용액 1mL를 해당 웰에 추가하고 1mL 멸균 피펫으로 최소 3회 위아래로 피펫팅하여 세포를 부드럽게 혼합합니다. 같은 튜브에 있는 모든 세포를 수집합니다.
   3. 300 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡인하고 1mL의 멸균 PBS에 세포를 재현탁합니다. 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화하고, 상층액을 흡인하고, 100μL의 멸균 PBS에 세포를 재현탁합니다.
   4. 세포 현탁액에 5μL의 7-AAD 염료(50ng/μL 스톡)를 추가합니다. 1mL 멸균 피펫으로 세포를 최소 3회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 10분 동안 배양하고 분석하기 전에 어둠 속에 두십시오.
4. 세포용해 능력 분석
   1. 7.3.4단계의 세포 현탁액을 혼합하고 5.1단계와 5.2단계를 한 번 반복합니다.
   2. New Specimen 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가하고 튜브 이름을 다음과 같이 지정합니다: Tube 1, K562 (또는 OC-3) cells only; 튜브 2, CFSE 염색 K562(또는 OC-3) 셀만 해당; 튜브 3, E : T = 5 : 1; 튜브 4, E:T = 10:1.
   3. 세포 용해 분석을 위한 Scatter Gating 시스템을 만듭니다(그림 2A).
      1. Tube 1을 선택하고 도트 플롯 버튼을 클릭하여 FSC-A/SSC-A 플롯을 생성합니다. FSC-A 임계값이 >5 x 10⁴인 모든 이벤트에 대해 사각형 게이트를 그려 세포 파편을 제외합니다.
      2. 새 점도표에 대한 SSC-A/CFSE 매개변수를 선택합니다. 새 점도표에 대한 7-AAD/CFSE 매개변수를 선택하고 4개의 하위 모집단을 정의하기 위해 4개의 사분면 게이트를 그립니다.
      3. Load Sample 버튼을 클릭하여 빈 대조군 샘플을 먼저 분석합니다.
      4. 볼륨을 조정하십시오.tage SSC-A 및 FSC-A의 e. CFSE 및 7-AAD 채널 매개변수를 사용하여 사멸 세포 집단을 식별합니다. 각 검체에서 >20,000 CFSE+ 세포의 데이터를 기록합니다.
   4. 모든 표본의 조사에 대해 섹션 7.4.6을 반복합니다.
   5. 각 개별 표본의 통계 값이 포함된 파일을 열어 생존 불가능한 세포 집단을 분석하고 데이터를 분석 파일로 내보냅니다.

결과

그림 1: 대표적인 PBMC 샘플에서 CD3⁺CD56⁺ T 세포의 비율. (A) 림프구는 특정 크기와 입도에 의해 인식되었습니다. 유세포분석법을 통한 분석을 위해 선택된 단일 세포 집단. (B) 3명의 건강한 기증자로부터 CIK 확장 효능에 대한 통계적 분석을 t-테스트(*, p < 0.01)를 사용하여 수행했습니다.

그림 2: 인간 만성 골수성 백혈병 K562 및 인간 난소암...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
7-아미노 악티노마이신 D	BD (영어)	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 항체	BD (영어)	555518	나159
APC 마우스 IgG1, κ 아이소타입 컨트롤	BD (영어)	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II 유세포 분석기	BD (영어)	338962		SN: R33896202856
카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFSE)	BD (영어)	565082		CFSE 염료(500mg)와 90mL의 DMSO를 재구성
D-(+)-포도당 용액	시그마	G8644		K562 세포 배양용. 12.5mL를 500mL의 완전 배지에 첨가
둘베코의 개조된 독수리 미디엄/F12	하이클론	SH30023.02		OC-3 세포 배양을 위한 기초 배지
소 태아 세럼	하이클론	SH30084.03		K562 및 OC-3 세포 배양용. 완전 배지에는 FBS의 10%가 포함되어 있습니다.
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어 생명과학	71101700-EK		밀도 구배 용액
FITC Mouse Anti-Human CD3 항체	BD (영어)	555332	우흐트1
FITC 마우스 IgG1, κ 아이소타입 제어	BD (영어)	555748	MOPC-21
인간 anti-CD3 mAb	타카라	T210	OKT3	2.5mL의 스톡(1mg/1mL)을 50mL의 인덕션 배지에 추가합니다. -80 °C에서 보관 재고
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122		500mL의 완전 배지에 5mL의 스톡(10,000 U/mL)을 추가합니다. 4 °C에서 재고를 보관하십시오.
프롤루킨	노바티스			1.2mL의 멸균수로 Proleukin Powder(22x106 IU)를 재구성하고 2.7mL를 50mL의 유도 배지에 추가합니다. -20 °C에서 보관 재고
재조합 인간 인터페론 감마	셀제닉스	1425-050		rh IFN-g(5x105 IU/50 μg)를 200 μL의 멸균수로 재구성하고 20 mL에서 50 mL의 유도 배지를 추가합니다. -20 °C에서 보관 재고
재조합 인간 인터루킨-1 알파	페프로텍	200-01ᅡ		rh IL-1α(10μg)를 멸균수 1mL로 재구성하고 5mL에 50mL의 유도 배지를 추가합니다. -20 °C에서 보관 재고
RPMI1640 매체	지브코	11875-085		K562 세포 배양을 위한 기초 배지. 4 °C에서 보관 재고
Sigma 3-18K 원심분리기	시그마	10295
TrypLE 익스프레스 효소	지브코	12605028		세포 해리 효소; 부착 세포의 분리용. 실온에서 보관
X-VIVO 15 미디엄	론자	04-418큐		PBMC 및 CIK 세포를 위한 기초 배지. 4°C에서 보관

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