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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 시약 준비
- 전체 조직 수집을 위한 배양 배지 스톡 용액 준비: Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM) 1L, Fetal Bovine Serum(FBS) 110mL, Penicillin-Streptomycin 11mL(최종 농도 1%) 및 필터 멸균 인슐린 1.1mL(최종 농도 0.1%). 재고 용액은 4 °C에서 보관하십시오.
- 킬레이트 완충액 #1: 배양 배지 30mL(1.1에 설명된 바와 같이), 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 600μL(최종 농도 10mM), 겐타마이신 300μL(최종 농도 1%) 및 암포테리신 B 60μL(최종 농도 0.2%). 재고 용액은 4 °C에서 보관하십시오.
- 킬레이트 완충액 #2 준비: 배양 배지 30mL(1.1에 설명된 바와 같이), 0.5M EDTA 300μL(최종 농도 5mM), 겐타마이신 300μL(최종 농도 1%) 및 암포테리신 B 60μL(최종 농도 0.2%). 재고 용액은 4 °C에서 보관하십시오.
- 인간 미니거트 배지 준비: DMEM/F-12 41.4mL, FBS 5mL(최종 10%), 페니실린-스트렙토마이신 500μL(최종 농도 1%), L-글루타민 500μL(최종 농도 1%), 겐타마이신 500μL(최종 농도 1%), 암포테리신 B 100μL(최종 농도 0.2%), 1M N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산(HEPES) 500μL(최종 농도 10mM), 500 μL의 100x N-2 보충제 및 1 mL의 50x B-27 보충제에서 비타민 A를 뺀 총 부피 50 mL. 재고 용액은 -20 °C에서 보관하십시오.
- 인간 미니장 배지 준비 완료: 인간 미니거트 배지 10mL(1.4에서 준비), 100μg/mL Wnt3a 10μL(최종 농도 100ng/mL), 100μg/mL Noggin 10μL(최종 농도 100ng/mL), 1mg/mL R-Spondin 10μL(최종 농도 1μg/mL), 500μg/mL 표피 성장 인자(EGF) 10μL(최종 농도 50ng/mL), 1M N-아세틸시스테인 10μL(최종 농도 1mM), 10mM Y-27632 10μL(최종 농도 10μM), 500μM A-83 10μL(최종 농도 500nM), 10mM SB202190 10μL(최종 농도 10μM), 100 μL 1 M 니코틴아미드 (최종 농도 10 mM) 및 1 μL 100 μM [leu] 15-gastrin 1 (최종 농도 10 nM). 총 부피 10mL. 재고 용액을 4 °C에서 보관하십시오 .
메모: 용액은 48시간 이내에 사용해야 합니다.
2. 전체 조직에서 크립트 분리 및 도금
- 수술실에서 채취 시 인간 소장 조직 샘플을 차가운 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)에 넣습니다. 대변과 피가 없어질 때까지 차가운 DPBS로 표본을 씻습니다. 시료를 암호화소 분리가 준비될 때까지 RPMI 1640 Medium에서 4°C로 보관합니다.
메모: 조직은 24시간 이상 보관할 수 없습니다.
- 표본에 대변과 혈액이 없는지 확인하십시오. 섬세한 해부 가위를 사용하여 과도한 지방이나 수술용 클립/스테이플 등을 제거합니다. 시편의 무게를 잰다.
참고: 약 0.75-2.5g 조각을 목표로 합니다.
- 검체를 0.5cm 조각으로 자르고 30mL의 킬레이트 버퍼 #1에 넣습니다(1.2단계에서 준비한 대로).
- 4°C에서 15분 동안 저속으로 흔듭니다.
- 100μm 세포 스트레이너를 통해 조직을 여과하고 플로우 스루를 버립니다.
- 조직을 30mL의 킬레이트 버퍼 #2에 추가합니다(1.3단계에서 준비한 대로).
- 4°C에서 15분 동안 저속으로 흔듭니다.
- 100μm 세포 여과기를 통해 조직을 여과하고 흐름을 버립니다.
- 2.8단계에서 사용하기 위해 얼음 위에서 500mL의 기저막 매트릭스를 해동합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에 담긴 10mL의 차가운 DMEM에 티슈를 넣고 10초 동안 손으로 세게 흔듭니다.
- 100μm 세포 스트레이너를 통해 필터링하고 flow through(라벨 #1)를 수집합니다. 튜브 #1을 얼음 위에 두십시오.
- 별도의 50mL 원뿔형 튜브에 담긴 또 다른 10mL의 차가운 DMEM에 조직을 넣고 10초 동안 손으로 세게 흔듭니다.
- 100μm 세포 스트레이너를 통해 필터링하고 플로우 스루(라벨 #2)를 수집합니다.
- 흐름이 있는 4개의 원뿔형 튜브(튜브 #1-4로 표시됨)가 나타날 때까지 두 번 더 반복합니다.
- 100μm 세포 스트레이너를 통해 튜브 #1 용액을 여과하고 15mL 원뿔형 튜브(라벨 #1)로 흐름을 전달합니다. #2-4에 대해 반복합니다.
- 원심분리기 15 mL 튜브 #1-4, 200 x g에서 4 °C에서 15분 동안.
- 층류 후드에서 튜브 #1-4의 상층액을 제거하고 폐기합니다. 펠릿 바로 위의 조직 구름을 방해하지 마십시오, 그것이 약간의 상층액을 남기는 것을 의미하더라도 말입니다.
- 천천히 피펫팅하여 펠릿과 튜브 #1-4에 남은 상등액을 함께 혼합합니다.
- 튜브 #1-4의 혼합물을 하나의 단일 2mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 원뿔형 튜브를 200 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 펠릿을 기저 멤브레인 매트릭스의 500μL에 다시 현탁시킵니다.
메모: 기저막 매트릭스를 항상 얼음 위에 유지하고 다음 단계를 위해 빠르게 작업하십시오. 이 제품은 실온에서 매우 빠르게 중합됩니다.
- 50μL의 표본/기저 멤브레인 매트릭스 현탁액을 24웰 플레이트의 웰 중앙에 적용합니다. 이것은 돔 모양으로 나타나야 합니다.
메모: 냉각된 피펫 팁을 사용하면 현탁액을 보다 부드럽게 전달하여 중합을 최소화할 수 있습니다.
- 총 9개의 웰을 채우기 위해 10회 반복합니다.
- 24웰 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 30분 동안 놓고 중합을 허용합니다.
- 각 웰에 500μL의 Human Minigut Media Complete(1.5단계에서 준비한 대로)를 추가합니다. 2일마다 교체하십시오.
- 5-10일 후에 싹이 트는지 시각화할 때 장내 세포를 수집합니다. 수집 지침은 4단계와 5단계를 참조하십시오.
3. 실험적 NEC 도입
- 0일차에 각 웰에 5mg/mL의 지질다당류(LPS) 10μL를 500μL의 Human Minigut Media Complete(1.5단계에서 준비)에 추가합니다. 수거할 때까지 2일마다 교체하십시오.