암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

초록

Najmeh, S., et al. 단순화된 인간 호중구 세포 외 트랩(NET) 분리 및 처리. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오에서는 형광 현미경을 사용하여 암세포가 호중구 세포외 트랩(NET)에 부착되는 것을 감지하는 분석을 시연합니다. 테스트 웰에서는 NET에 부착된 형광 표지된 암세포의 수가 눈에 띄게 증가한 반면, DNase로 처리된 웰은 NET에 대한 암세포 부착력이 감소한 것으로 나타났습니다.

프로토콜

1. NET-암세포 정적 접착 분석

1. 96웰 평평한 바닥판에 웰당 이전에 얻은 순 스톡의 100μl를 추가하고 어둠 속에서 4°C에서 웰 O/N을 코팅합니다.
2. 12시간에서 20시간 사이에 현미경으로 웰 바닥에서 cell-free NET의 균일한 단층이 형성되는지 확인합니다(그림 1). 이 시점에서 웰에서 비접착성 물질을 모두 부드럽게 흡인하여 바닥의 NET 단층이 중단되지 않도록 합니다.
3. 각 웰에 1% 소 혈청 알부민(BSA) 차단 용액 100μl를 추가하고 RT에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
4. 0.25% 트립신 용액 2ml를 사용하여 T-75 플라스크에서 A549 암세포를 분리합니다. 분리된 후 10ml의 A549 배지를 트립신화된 세포에 추가하고 450 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지에 상등액을 버리고 세포를 재현탁시켜 100μl 배지당 2 x10⁴개의 암세포 농도를 얻습니다.
   메모: A549 세포는 별도로 성장시켰다. 간단히 말해서, 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM F12 배지에서 세포를 배양 및 유지하고 37°C 5%_CO2

결과

그림 1. NET 단층. NET으로 코팅된 96웰 플레이트 웰의 광학 현미경 이미지는 (A) 웰 전체에 걸쳐 균일한 NET의 단층을 보여주며, (B) 중단된 NET 층으로 웰을 부적절하게 코팅한 것을 보여줍니다. 눈금 막대는 40μm를 나타냅니다.

그림 2. In vitro adhesion assay의 결과. GraphPad 소프트웨어를 사용하여 NET에 대한 A549 암세포 접착 분석.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS), 변형, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음	들소	311-425-CL
RPMI-1640 L-글루타민 함유 배지	들소	350-000-CL	3% RPMI 용액은 RPMI에 3% 소 태아 혈청을 보충하여 만듭니다
BD Pharm Lyse 용해 완충액	BD 바이오사이언스	555899
DNAse1	로슈	11284932001
F12 DMEM	들소	Tel.: 319-075-CL
소 태아 세럼(FBS)	들소	제080-150
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140-122
증권 시세	인비트로젠	C1157 (영문
0.25% 트립신-EDTA	지브코	제25200-056

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