방법 논문

박테리아 세포 염색 및 면역학 연구를 위한 준비

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Yang, J. et al., 숙주 세포에 대한 박테리아 부착의 자동화, 고처리량 검출.J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 적색 형광 염료를 사용하여 면역학 연구를 위한 박테리아 세포의 염색 및 준비를 보여줍니다. 염색된 박테리아는 숙주 세포 감염을 위한 원하는 박테리아 농도를 달성하기 위해 성장 배지에서 희석되고 재현탁되며, 이는 감염의 다양성을 나타냅니다.

프로토콜

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1. 세균 성장 및 염색

  1. 생물 안전 캐비닛, 생물 안전 레벨 2 실험실에서 모든 박테리아 작업을 수행하십시오.
  2. 냉동 글리세롤 스톡에서 녹농균(PAO1), 대장균, 리스테리아 모노사이토제네스, 바실러스 서브틸리스 등을 포함한 모든 박테리아 배양액을 접종하고 37°C의 진탕 인큐베이터에서 250rpm으로 하룻밤 동안 유지되는 Tryptic Soy Broth(TSB, 3mL)에서 배양합니다.
  3. 다음날, 하룻밤 배양을 1:100 희석하여 하강배양을 접종하고 TSB(1mL)에서 지수 단계로 3시간 동안 성장시키고 600nm(OD600)에서 광학 밀도, OD를 측정하여 확인합니다.OD600이 0.4-0.6 범위에 있는지 확인합니다.
  4. 박테리아-숙주 부착 분석을 수행하기 전에 TSB-한천 플레이트에 박테리아 현탁액을 플레이트에서 연속적으로 희석하고 37°C에서 밤새 배양한 다음 콜로니 수에서 박테리아 콜로니 형성 단위(CFU)를 설정합니다. 녹농균의 경우 OD600 1.0은 2 x 108 생존 가능한 박테리아 세포/mL에 해당하고, L. monocytogenes의 경우 1.0의 OD600은 9 x 108 생존 가능한 박테리아 세포/mL에 해당합니다.
  5. 실온(RT)에서 2분 동안 13,000 x g에서 원심분리하여 지수 단계에서 박테리아 배양물을 수확한 다음 1x 인산염 완충 식염수(PBS 1mL)를 사용하여 한 번 세척합니다. 1 mL의 1x PBS에 박테리아 펠릿을 재현탁시키고 OD600의 박테리아 현탁액을 측정하여 농도를 측정합니다. 예를 들어, OD600이 0.5인 녹농균은 1 x 108 박테리아 세포/mL의 농도를 나타냅니다.
  6. RT에서 녹색 또는 빨간색 형광 염료를 사용하여 어두운 곳에서 부드럽게 회전하면서 30분 동안 박테리아 현탁액을 염색합니다. 이를 위해 500배 농축 원료 염색 염료 2μL를 1mL의 박테리아 현탁액에 첨가하여 염료를 1배 희석합니다. 염색 염료를 씻어내려면 염색된 박테리아를 13,000 x g에서 2분 동안 원심분리하고 펠릿을 1x PBS 1mL에 3회 재현탁합니다.
    메모: 형광-(녹색 형광 단백질(GFP-), 적색 형광 단백질(RFP-), mCherry- 등) 태그가 지정된 박테리아를 실험에 사용하는 경우 이 박테리아 염색 단계를 건너뜁니다. GFP-표지된 녹농균(P. aeruginosa) 및 적색 형광 염료 염색 L. 모노사이토제네스(L. monocytogenes)가 이 프로토콜에 사용되었습니다.
  7. 염색된 박테리아 세포 또는 GFP 태그가 붙은 박테리아를 13,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 수집합니다. 새로운 F-12K 배지(1mL)에 재현탁하고 각 배양액의 OD600을 측정합니다. 순차적으로 배양물을 감염의 다양성(MOI) 및 숙주 세포 농도에 따라 원하는 농도로 희석합니다. 이 실험에 사용된 최종 부피는 500μL.
    입니다. 메모: 예를 들어, Trypan Blue 염색을 사용하여 계수된 숙주 세포 농도가 1 x 105 cells/mL인 경우 MOI 100에서 원하는 박테리아 세포 농도는 1 x 107 cells/mL가 됩니다. 0.5 OD600에서 녹농균의 농도는 1 x 108/mL입니다. 원하는 농도를 얻으려면 녹농균 배양액을 10배 희석하고 450μL의 새로운 F-12K 배지에 50μL의 재현탁 배양액을 추가합니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBS 10배폭스바겐45001-130
BactoView 라이브 레드비오티움40101박테리아 staning 염료
원심 분리기에펜도르프5810R
대장균실험실 재고
F-12K 중형증권 시세 302004A549 세포 배양 배지
소 태아 세럼코 닝35-016-이력서
L. 모노사이토제네스NIST 컬렉션
OD600 딜루 광도계임플렌
녹농균Dr. Lori Burrows 실험실 주식
녹농균 ΔpilADr. Lori Burrows 실험실 주식
S. 아갈락티아과NIST 컬렉션
S. 아우레우스베이NR-46543
S. 아우레우스 ΔsaeR베이NR-48164
S. 루비다과NIST 컬렉션
전형적인 콩 육수그로우셀MBPE-4040
년 표시기

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