유세포 분석을 사용한 박테리아 표면에 대한 Vitronectin 결합 검출

Abstract

출처: Singh, B. et al., 세균 접착 및 혈청 저항성에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 비트로넥틴과 박테리아 표면 단백질의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 유세포 분석 분석은 비트로넥틴에 결합된 형광 표지 항체의 형광 신호를 측정하여 박테리아 표면에서 그 존재를 확인합니다. 이 기술은 숙주-병원체 상호 작용 및 잠재적인 박테리아 감염 요법에 대한 통찰력을 제공합니다.

Protocol

1. 박테리아 표면 단백질 리간드로서의 Vitronectin, Vn 분석

1. 유세포 분석을 사용한 박테리아 표면의 Vn 결합 검출
   메모: 유세포 분석에서는 side scatter 및 forward scatter를 사용하여 positive 이벤트를 게이트했습니다. Vn, 헤모필루스 인플루엔자 f형, Hif 임상 분리물(n=10)을 대장균 BL21(DE3)과 함께 음성 대조군으로 선택했습니다(그림 1A).
   1. 10μg/mL 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)가 보충된 뇌-심장 주입(BHI) 배지와 200rpm에서 진탕으로 37°C의 헤민을 배양한 Hif 임상 분리물. Luria-Bertani 배지를 사용하여 E. coli를 배양하십시오. 중간 로그 단계(광학 밀도, OD₆₀₀ = 0.3)에서 Hif를 수확하고 1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2(차단 완충액; PBS-BSA)에 의해 작성되었습니다. 현탁액을 10⁹ 콜로니 형성 단위, CFU/mL로 조정합니다.
   2. 5 x 10⁶ CFU가 포함된 부분 표본을 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브(12 x 75 mm²)로 옮기고 1mL의 차단 버퍼를 추가합니다. 현탁액을 3,500 × g의 실온(RT)에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거하기 위해 조심스럽게 흡인합니다.
   3. 250nM Vn을 함유한 50μL의 차단 버퍼로 박테리아 펠릿을 재현탁하고 흔들림 없이 RT에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 3,500 x g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화한 다음 PBS 및 유사한 원심분리 단계를 사용하여 펠릿을 세 번 세척합니다.
   4. 박테리아 펠릿에 PBS-BSA에서 1:100 희석으로 50μL의 1차 양 항인간 Vn 다클론 항체(pAb)를 추가합니다. RT에서 1시간 동안 현탁액을 배양한 다음 PBS로 박테리아를 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다(1.1.3단계 참조).
   5. 다음으로, FITC(fluorescein isothiocyanate) 공액 당나귀 항양 pAbs(1:100 희석)를 함유한 PBS-BSA 50μL를 추가하고 어둠 속에서 1시간 동안 RT에서 배양합니다.
   6. 차단 버퍼만 있는 박테리아와 Vn이 없는 pAbs를 배양하여 빈 대조군을 준비합니다.
   7. 1mL의 차단 버퍼로 박테리아를 세 번 세척하고 섹션 1.1.2에 설명된 대로 원심분리로 현탁액을 펠렛화합니다. 마지막으로, 박테리아 펠릿을 300μL의 PBS로 재현탁하고 유세포 분석으로 분석합니다.

Results

그림 1: 헤모필루스 인플루엔자 혈청형 f는 표면 발현 PH를 통해 Vn과 결합합니다.(A) Hif 임상 분리물의 세포에 대한 Vn의 결합을 보여주는 유세포 분석 결과. 각 임상 분리물(5 x 10⁶ CFU)을 250 nM human Vn으로 배양하였다. 결합된 리간드는 양 항-Vn pAbs 및 FITC-conjugated 당나귀 항-양 2차 항체를 사용하여 검출하였다.대장균 BL21(DE3)은 음성 대조군으로 포함되었다. 데이터는 세 가지 개별 실험에서 삼중 분석의 평균 형광 강도로 표시되며 오차 막대는 SD를 나타냅니다. (B) WT Hif M10 및 PH 결실 Hif M10...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브	BD 팔콘	60819-138	12 × 75mm 스타일
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A2058 (영어	세포 배양에 적합
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	651154	연구 응용 분야를 위한 세포 분석 등급
인간 혈장에서 추출한 비트로넥틴(Vn)	시그마-알드리치	V8379-50UG	세포 배양 등급
대장균 숙주(E. Coli BL21)	노바젠	69450-3	단백질 발현 숙주
FITC-conjugated donkey anti-sheep 항체	AbD 세로텍	STAR88F	다클론성
Sheep anti-human Vn 항체와 관련상품	AbD 세로텍	AHP396	다클론성