Phospho-Flow Cytometry를 사용한 Stromal Cytokine-Induced intracellular protein phosphorylation 평가

초록

출처: Coats, J. S., et al. 사이토카인 형질도입 기질 세포주 주입을 통한 환자 유래 이종이식편에서 외인성 사이토카인의 발현. J. Vis. 특급 (123) (2017).

이 비디오는 백혈병 세포에서 단백질의 기질 사이토카인 유도 세포 내 인산화의 평가를 보여줍니다. 이러한 세포 내 인산화된 단백질은 phospho-flow cytometry 기술을 사용하여 정량화됩니다.

프로토콜

1. stroma에 의해 생성된 사이토카인의 활성을 평가하기 위한 인산 유동 세포 분석

분석

참고: 개별 실험에서 스트로마 생성 사이토카인의 관련 생체 활성을 확인하기 위해 첫 번째 실험 전에 엔지니어링된 기질의 상층액을 평가합니다. 엔지니어링된 기질이 검증되면 새로운 벡터로 생산된 기질이 도입되지 않는 한 추가 테스트가 필요하지 않습니다.

1. MUTZ5 및/또는 MHH-CALL4 백혈병 세포주(TSLP 반응성), 재조합 인간 사이토카인 및 인유세포 분석 분석에 사용하도록 승인된 항체를 구매하여 적절한 다운스트림 인산화 표적을 검출합니다.
2. 대조군에서 수확된 상등액과 사이토카인 발현 기질에서 해동.
3. 백혈병 세포주를 R20 배지(재료 표 참조)의 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당^0.2 x 10 6개의 세포 농도로 플레이트화합니다. 3중 분석을 허용하기 위해 조건당 3개의 웰을 플레이트화합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오. 이 시간은 이전 배양 조건에서 발생한 인산화가 손실될 수 있습니다.
   참고: 세포주당 12웰은 1.4단계에 표시된 각 실험 조건에 대해 ....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 mL 혈청학적 피펫	송골매	357551
15mL 폴리프로필렌 코니컬 튜브	어부	05-539-12
50mL 폴리프로필렌 코니컬 튜브	송골매	352098
1 mL 피펫 팁	어부	2707509
200 μL 피펫 팁	덴빌 사이언티픽	P3020-CPS(크립스)
10 μL 피펫 팁	덴빌 사이언티픽	P-1096-CP
"R20" 세포 배양 배지, 총 부피의 %(195mL 제작)			실험실 레시피
RPMI, 76.84%(150mL)	미디어테크	10-040-이력서
FBS, 20.49%(40mL)	미디어테크	35-011-이력서
2mM L-글루타민, 1.02%(2mL)	미디어테크	35-011-이력서
1 mM Na 피루브산염, 1.02% (2 mL)
페니실린-스트렙토마이신, 0.51%(1mL	미디어테크	30-002-CL
2-메르캅토에탄올, 0.10%(0.1m), 0.10%(200μL)	MP	190242
생물제제
"CALL-4" MHH-CALL-4 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병	디에스엠즈	ACC 337
MUTZ-5 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병	디에스엠즈	ACC 490
재조합 인간 TSLP 단백질	R&D 시스템	1398-TS-010
유세포 항체(클론)*
안티 마우스 CD45 FITC (30F11)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (다른 이름은 IL-7Rα)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-098-094
CD34 APC(8G12)	BD 바이오사이언스	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	이바이오사이언스	제25-0459
"FVD" 고정성 생존도 염료 eFluor 780	이바이오사이언스	Tel.: 65-0865
Ig κ 경쇄 FITC (G20-193)	BD 파밍겐	555791
Ig λ 경쇄 FITC (JDC-12)	BD 파밍겐	561379
IgD PE (IA6-2)	바이오레전드	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD 바이오사이언스	551079
pSTAT5 PE, 마우스 anti-STAT5 (pY694)	BD 포스포플로우	612567
다른 재료 & 장비
FlowJo 유세포 분석 소프트웨어	플로우조, LLC	버전 10
*모든 항체는 달리 명시되지 않는 한 반인체적입니다.

(영문) (영문) 호