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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 고정 및 파라핀 임베딩을 위한 조직 준비
참고: 재발성 요로 감염(rUTI)의 고급 관리를 위해 삼각염의 전기 흡수로 방광경 검사를 받는 데 동의한 여성으로부터 생검을 실시했습니다. 재발성 요로 감염(rUTI)은 12개월 동안 3회의 요로감염으로 정의됩니다. 생검 채취는 환자가 마취 중인 상태에서 환자의 동의를 얻은 후 수술실에서 수행되었습니다. 모든 샘플은 실험 전에 코딩되고 비식별화되었습니다.
- 유연한 방광경을 통해 비뇨기과 겸자가 있는 방광 삼각선에서 콜드 컵(~1mm3) 생검을 받고 1x 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에서 준비된 1.5mL의 4% v/v 파라포름알데히드(PFA)가 포함된 멸균 2mL 냉동 비타민에 즉시 넣습니다.
참고: 1x PBS에 있는 4% PFA는 미리 만들어 필요할 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 실온에서 6시간 또는 4°C에서 16-24시간 동안 생검을 수정합니다.
참고: 고정 기간은 조직 샘플의 크기에 따라 계산해야 하며 과도한 고정은 피해야 합니다. 글루타르알데히드는 자가형광을 유발하므로 고정제로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 멸균된 후드 또는 생물 안전 캐비닛에서 피펫팅으로 고정제를 제거하고 1.5mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 교체합니다. 샘플을 하룻밤 동안 4°C에서 보관하거나 즉시 조직 처리 및 파라핀 포매를 수행합니다.
- 멸균된 마이크로톰을 사용하여 5μm 두께의 조직 블록을 절단하고 파라핀 조직 절편을 하전 유리 현미경 슬라이드에 부착합니다. 16S 리보솜 RNA(16S rRNA) 형광 FISH(in situ hybridization) 프로토콜에 대해 생검당 최소 2개의 슬라이드가 필요합니다.
참고: 생검 조직은 모든 섹션에서 요로상피층의 시각화를 보장하기 위해 절단면을 기준으로 단면적으로 배열되어야 합니다. 또한 단면 두께는 박테리아 군집 검출을 위해 최적화되어야 한다는 점에 유의해야 합니다. 조직 상주 박테리아가 극히 드문 감염의 경우 더 얇은 절편 또는 여러 연속 절편의 샘플링이 필요할 수 있습니다(예: 포유류 세포 1,000개당 <1개의 조직 상주 박테리아).
2. 범용 16S rRNA 프로브를 사용한 형광 현장 혼성화
참고: 생검당 두 개의 슬라이드가 필요합니다. 하나의 슬라이드는 범용 16S rRNA 프로브에 필요하고 다른 하나의 슬라이드는 스크램블된 염기서열이 있는 대조군 프로브에 필요합니다. 이는 방광 상피가 여러 채널에서 자동 형광성이기 때문에 현미경 검사 중 실제 신호와 배경 신호를 구별하는 데 중요합니다. 스크램블 프로브 외에도 장착 전에 0.1% Sudan Black B로 차단하면 조직에 내재된 배경 자가형광이 감소할 수 있습니다.
- 시약 및 흄 후드의 준비
- 빈 흄 후드(또는 적절하게 장착된 생물 안전 캐비닛)를 70% 에탄올로 청소하십시오.
- 멸균 여과수 10mL에 0.9M 염화나트륨(NaCl), 20mM 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄-염산염(Tris-HCl, pH 7.2), 0.1% 도데실황산나트륨(SDS)으로 구성된 혼성화 완충액을 준비합니다.<브롬/>
참고: 멸균 여과수는 오토클레이브 증류수를 0.22μM 필터에 통과시켜 준비할 수 있습니다. 혼성화 완충액은 실온에서 보관할 수 있지만 SDS는 용액에서 침전될 수 있습니다. SDS가 침전되면 사용하기 전에 50°C 수조에서 용액을 데우십시오.
- 세척된 오토클레이브 병의 멸균 여과수에 각각 95% 및 90% 에탄올을 각각 최소 100mL 이상 준비합니다.
- 필터 멸균된 뉴클레아제가 없는 물에서 준비된 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 완충액(TE)에 형광 표지된 동결건조 프로브를 100μM의 최종 농도로 용해합니다.이 프로토콜에 사용하기 위해 TE 완충액에 1μM의 희석액을 준비합니다. 100 μM 농축 스톡과 1 μM 스톡으로 재구성 된 프로브를 모두 -20 °C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
알림: 형광 표지된 프로브를 물에 녹이지 마십시오. 형광단을 뉴클레오티드 프로브에 접합하는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 결합의 가수분해를 방지하기 위해 완충이 필요합니다.
- 5개의 Coplin 용기에 70% 에탄올(EtOH)을 세척하고 건조시킨 다음 자일렌 I, 자일렌 II, 95% EtOH, 90% EtOH, 이중 증류수(ddH2O)로 라벨을 붙인 다음 적절한 용액 100mL를 채웁니다. 이렇게 하면 이후 단계에서 혼동을 방지하는 데 도움이 됩니다.
- 조직 탈파라핀화 및 재수화
- 후드에서 생검당 두 개의 슬라이드를 수직 슬라이드 랙에 놓습니다.
- 수직 슬라이드 랙을 xylenes I Coplin 병(자일렌 100mL 포함)에 10분 동안 놓습니다.
- 크실렌 I에서 슬라이드 랙을 제거하고 종이 타월로 바닥을 닦아 여분의 자일렌을 제거합니다. 크실렌 II 코플린 항아리에 10분 동안 넣습니다.
알림: 인증된 흄 후드 밖에서 자일렌으로 작업하지 마십시오.
- 파라핀화된 조직 절편을 각각 라벨이 붙은 Coplin jars에서 각각 10분 동안 연속적인 에탄올 세척(95% 및 90%)으로 재수화합니다.
알림: 이 s에서tage, 수조에서 혼성화 버퍼를 50-56 °C로 가열합니다.
- 90% 에탄올 세척에서 슬라이드 랙을 제거하고 종이 타월로 바닥을 닦아 과도한 에탄올을 제거한 다음 100mL의 필터 멸균 ddH2O가 들어 있는 ddH2O Coplin 용기에 10분 동안 넣습니다.
- ddH2O 세척을 기다리는 동안 혼성화 완충액에서 프로브를 10nM로 희석하여 염색 용액을 생성합니다. 슬라이드당 150μL의 염색 용액을 준비합니다.
알림: 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 서랍에 보관하여 얼룩 용액을 빛으로부터 보호하십시오. 벤치탑에서 형광 표지된 프로브로 작업할 때는 가능하면 천장 조명을 끄는 것이 좋습니다. 혼성화 완충액에 희석된 프로브는 재사용해서는 안 됩니다.
- 혼성화(hybridization) 및 카운터 염색(counter-staining)
- P1000 팁 상자의 저장통에 흠뻑 젖고 구겨진 Kimwipe와 멸균수를 넣어 각 프로브에 대한 가습 챔버를 준비합니다. 팁 홀더 카트리지를 맨 위에 놓습니다 - 슬라이드가 놓일 위치입니다.
참고: 혼성화 중에 생검 섹션이 건조해지는 것을 방지하기 위해 가습실을 사용하는 것이 중요합니다. 시중에서 판매되는 가습기 챔버는 안정적이고 습한 분위기를 유지하도록 설계되었다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 여기에 자세히 설명된 기술은 훨씬 적은 비용으로 습도를 충분히 제어합니다.
- 슬라이드 랙에서 슬라이드를 제거하고 새 종이 타월 위에 놓습니다(티슈 면이 위로 향하게). Kimwipe를 사용하여 슬라이드를 말리십시오. 물을 흡수하기 위해 생검 섹션 근처(위가 아님)만 부드럽게 두드리도록 주의하십시오. 소수성 펜을 사용하여 생검 섹션 주위에 테두리를 그리고 슬라이드 조직 면이 위로 향하게 하여 가습실에 놓습니다.
참고: 교잡 전에 조직이 건조되지 않도록 신속하게 작업하십시오.
- 가습 챔버를 50 °C로 설정된 인큐베이터에 놓습니다. 염색 용액 50-150 μL를 조직 바로 위에 피펫으로 씌워 조직 주위의 소수성 경계에 의해 만들어진 직사각형이 채워지도록 합니다. 소수성 경계를 넘치기 위해 너무 많은 용액을 추가하지 않도록 주의하십시오. 상자를 부드럽게 닫습니다.
- 어둠 속에서 50 °C에서 하룻밤(~16시간) 배양합니다. 인큐베이터에 창문이 있으면 알루미늄 호일로 덮어 어두운 환경을 만드십시오.
알림: 신뢰할 수 있는 신호를 위해서는 FISH 프로브의 용융 온도보다 낮은 혼성화 온도가 필요합니다. 50°C는 범용 16S rRNA 프로브의 최적 온도이지만 다른 프로브의 경우 최적이 아닐 수 있습니다.
- 다음날 아침, ddH2O에 0.9 M 염화나트륨(NaCl)과 20 mM Tris-HCl(pH 7.2)로 구성된 최소 500mL의 세척 완충액을 준비하고 진공 병탑 필터가 있는 멸균 병으로 필터 멸균합니다. 수조에서 50-56 °C로 데우십시오.
- 가습실에서 슬라이드를 제거하고 Kimwipe로 남아 있는 혼성화 용액을 조심스럽게 흡수합니다. 슬라이드를 수직 염색 랙에 놓습니다.
- 100mL의 예열된 세척 버퍼가 들어 있는 불투명한 Coplin 용기에 염색 랙을 10분 동안 놓습니다. Coplin 항아리가 불투명하지 않은 경우(예: 유리) 배양 단계 중에 상자 아래 또는 서랍과 같은 어두운 곳에 두십시오.
- 새 Coplin 용기에 새 Wash 버퍼를 사용하여 세척 단계를 두 번 반복합니다.
- 세척 단계에서 세척 버퍼에 Hoechst 33342 1:1,000의 100μg/mL 스톡 용액을 희석하여 카운터 염색을 준비합니다. 동일한 튜브에 Alexa-555 밀 배아 응집소(WGA)를 최종 농도 5μg/mL에 추가하고 Alexa-555 Phalloidin을 최종 농도 33nM에 추가합니다. 사용할 준비가 될 때까지 어두운 곳에 보관하십시오.
알림: Hoechst, Alexa-555 WGA 및 Alexa-555 Phalloidin은 각각 디옥시리보핵산(DNA), 뮤신/우로플라킨 및 액틴을 표시하며 제조업체의 지침에 따라 어두운 곳에 장기간 보관할 수 있습니다. 프로브 및 대조 염색에 사용되는 형광 라벨은 현미경에 사용할 수 있는 필터 세트에 맞게 사용자 정의할 수 있습니다.
- 마지막 세탁에서 슬라이드를 제거하고 Kimwipe로 여분의 세탁 버퍼를 부드럽게 흡수합니다. 종이 타월 위에 슬라이드 면이 위로 향하게 놓고 조직 위에 직접 50-150μL의 카운터 스테인을 추가하여 소수성 경계가 채워지지만 넘치지 않도록 합니다. 크라이오 박스 탑으로 최대 4개의 슬라이드를 덮고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 측면을 염색 랙에 다시 넣고 새 세척 버퍼를 사용하여 Coplin 용기에서 각각 10분 동안 두 번 더 세척합니다.
- 마지막 세척 후 슬라이드를 완전히 말리고 크라이오 박스 상단 아래의 종이 타월에 티슈 면이 위로 향하게 놓습니다. 티슈 위에 마운팅 미디어 한 방울을 직접 짜냅니다. 적절한 크기의 커버슬립(생검 크기에 따라 다름)을 위에 부드럽게 놓습니다. 이미징을 방해할 수 있으므로 거품을 부드럽게 누르고 덮개가 미끄러진 슬라이드가 어둠 속에서 밤새 경화되도록 합니다.
- 다음 날, 투명 매니큐어를 살짝 발라 커버슬립의 가장자리를 슬라이드에 밀봉합니다. 어두운 곳에서 10분 동안 건조시킨 다음 컨포칼 현미경 검사를 위해 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
3. 컨포칼 현미경에 의한 16S rRNA FISH의 시각화
참고: 이 프로토콜의 경우 63x 및 100x 대물렌즈가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. Hoechst, Alexa-488 및 Alexa-555 형광을 시각화하기 위한 적절한 필터 세트가 필요합니다. 그러나 컨포칼 현미경을 사용할 수 없는 경우 표준 형광 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 위한 것입니다.
- 제조업체의 지침에 따라 컨포칼 현미경과 현미경과 연결된 컴퓨터 소프트웨어를 켭니다.
- 슬라이드를 로드하고 파란색(Hoechst) 채널의 10x 대물렌즈로 시각화합니다. 핵이 보일 때까지 조심스럽게 초점을 맞춥니다.
- 초점이 맞춰지면 대물렌즈를 고배율(63x 또는 100x)로 변경합니다. 커버슬립 위에 오일을 바르십시오. 초점을 맞추는 동안 대물렌즈가 오일과 접촉하도록 하여 새로운 대물렌즈로 다시 초점을 맞춥니다.
참고: 고배율(63x 또는 100x)에서는 미세한 초점만 사용하십시오. 오일은 오일 목적에만 사용해야 합니다.
- 녹색(향상된 녹색 형광 단백질, eGFP/Alexa-488) 채널의 접안렌즈를 통해 각 슬라이드를 빠르게 평가하여 어떤 슬라이드가 FISH 양성이고 어떤 슬라이드가 FISH 음성인지 확인합니다.
참고: 이 초기 평가/채점은 실험적 편향을 줄이기 위해 별도의 개인에 의해 맹검으로 수행되는 것이 가장 좋습니다.
- 염색된 생검을 이미지화하려면 FISH 포지티브 슬라이드로 시작하여 컴퓨터 시각화 모드로 전환합니다. 405(Hoechst), 488(Alexa-488) 및 555(Alexa-555) 채널을 선택합니다. 가장 긴 파장 채널(이 경우 555)을 사용하여 핀홀을 설정합니다. 488 채널에서 표지된 박테리아를 시각화하기 위한 올바른 초점면을 찾습니다. 초점면을 변경하지 않고 신호가 포화되지 않고 배경이 과도하게 보정되지 않도록 각 채널에 대한 게인, 레이저 출력 및 오프셋을 설정합니다. 세 채널 모두에서 이미지를 획득합니다.
참고: 488 채널에 대해 동일한 설정을 사용하여 실험의 모든 슬라이드를 이미지화합니다. 박테리아 시각화를 위한 최적의 초점면이 필드 간에 변경되는 경우 레이저 출력의 조정이 필요할 수 있습니다.