세포사멸 T 세포의 UV 조사 매개 생성을 위한 In vitro 기술

초록

출처: Hodge, M. X., et al. 오존 노출 후 폐포 대식세포 효능증의 생체 내 평가. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 인간 T 림프구 백혈병 세포주인 Jurkat 세포에서 세포사멸을 유도하는 방법을 보여줍니다. 세포는 자외선 C(UVC) 방사선에 노출되어 광범위한 DNA 손상을 일으키고 자가사멸 세포 사멸을 유발합니다.

프로토콜

1. Jurkat T 세포주 준비(2일차)

참고: 모든 절차는 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 37°C + 5% CO₂에서 24mL의 기저 세포 배양 배지 + 10% FBS + 5% 페니실린/스트렙토마이신에서 Jurkat T 세포를 배양합니다(재료 표). Jurkat T cell은 3일마다 1:6-1:8을 예열된 배양 배지에 전달하여 유지할 수 있는 현탁 세포주입니다. 흔들지 마십시오.
2. 세포사멸 세포를 준비하려면 각 플라스크에서 90% 농도로 성장시킵니다(통과 후 달성하는 데 3-4일 소요). 이 연구에서는 5개의 T75 플라스크에서 추출한 세포를 사용하여 이 프로토콜에 사용되는 충분한 수의 세포를 얻습니다.
   메모: 융합 플라스크에는 약 20-2,400만 개의 세포가 포함되어 있습니다.
3. 각 플라스크(약 24mL)에서 세포(전체 플라스크)를 피펫으로 올리고 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 멸균 50mL 원뿔형 튜브로 이동합니다. 여러 플라스크에 여러 개의 원추형 튜브를 사용합니다.
4. 50mL 코니컬 튜브에서 11μL의 세포 분취액을 제거하여 세포 수를 계산하고 11μL의 트리판 블루 염색 및 피펫 11μL를 혈구계 슬라이드에 혼합합니다.
5. 슬라이드를 자동 세포 카운터에 삽입하고 각 플라스크에 24mL의 배지가 포함되어 있으므로 살아있는 세포 수에 24를 곱하여 각 플라스크의 총 세포 수를 계산하기 위해 살아있는 세포의 수를 기록합니다.
6. 271 x g의 세포 현탁액을 실온(RT)에서 5분 동안 펠릿 세포로 원심분리합니다.
7. 흡인에 의해 상등액을 버리고 배지에 세포 펠렛을 재현탁하여 mL당 3.0 x 10⁶ 세포를 얻습니다.
8. 100 mm x 20 mm 조직 배양 접시에 5 mL의 세포를 분주합니다(약 9개의 접시가 사용되며, 각 접시의 총 세포 양은 ~15 x 10⁶이어야 함).
9. 제어/비노출을 위해 한 접시를 사용하고 나머지 접시는 UV에 노출됩니다.
10. UV 가교제를 올바른 에너지 수준으로 설정하고 에너지 버튼을 누른 다음 숫자 패드를 사용하여 "600"을 입력하면 기계가 600 μJ/cm² x 100.
    로 읽습니다. 메모: UV 가교제 에너지 단위는 μJ/cm² x 100입니다. 따라서 60 millijoules/cm²를 달성하려면 UV 교차결합제와 일치하도록 단위를 변환하십시오.
11. UV crosslinker를 사용하여 60mJ/^cm2에서 대조군을 제외한 모든 접시에 세포를 조사합니다. 자외선은 플라스틱 덮개를 관통하지 않으므로 UV 노출 중에는 조직 배양 접시의 상단 덮개를 제거하십시오.
12. 노출되지 않은 대조군을 포함하여 세포 배양 인큐베이터의 모든 접시를 37°C에서 5% CO₂로 4시간 동안 배양합니다.
13. 제조업체의 지침에 따라 배양 4시간 후 annexin V 및 propidium iodide (PI)(각각 apoptosis 및 necrosis에 대한 마커)가 포함된 apoptosis 분석 검출 키트를 사용하여 유세포 분석으로 apoptosis를 확인합니다.
    메모: 4시간 배양 후 600 μJ/^cm2의 에너지 수준으로 UV 교차결합제에 Jurkat T 세포를 조사하면 후기 자가사멸 표현형보다 더 많은 초기 자가사멸 표현형을 갖는 ≥75%의 세포사멸(초기 및 후기 모두) 세포가 됩니다. 이것은 폐포 대식세포가 후기 세포사멸 세포와 달리 막이 손상되지 않기 때문에 폐포 대식세포가 더 쉽게 인식하고 삼킬 수 있도록 하며, 이 연구에서 폐포 대식세포 발포세포증의 더 높은 발포세포 지수와 더 정확한 이미징으로 이어집니다.
    1. 여러 접시("UV 노출되지 않음" 및 "UV 노출" 모두)에서 333 μL(1 x 10⁶ 셀)의 Jurkat T 세포를 함께 풀링하여 보상 분석 튜브에 사용합니다.
    2. 염색되지 않은 Annexin V 단일 염색, PI 단일 염색, UV 제어 없음 및 600 μJ/cm² UV 노출 표지된 유세포 분석 튜브에서 Jurkat T 세포 333 μL를 분취합니다.
    3. RT에서 5분 동안 188 x g의 원심분리기 튜브를 삽입하고 상층액을 디캔팅합니다.
    4. 500μL의 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하여 세포를 세척합니다.
    5. RT에서 5분 동안 188 x g의 원심분리기 및 펠릿 세포. 원심분리 후 상등액을 폐기합니다.
    6. 세포가 원심분리하는 동안 10x 결합 완충액을 증류수로 희석하여 플로우 튜브당 400μL의 1x 결합 완충액을 준비합니다.
    7. 제조업체의 지침에 따라 annexin V 및 PI 배양 시약(샘플/튜브당 100μL)을 준비합니다.
    8. 원심분리 후 상등액을 디캔팅하고 모든 튜브를 400μL의 1x 결합 완충액에 부드럽게 재현탁한 다음 각 샘플 튜브에 100μL의 annexin V 배양 시약을 추가합니다. 마지막으로, 100μL의 annexin V 단일 염색 및 PI 단일 염색을 각각의 튜브에 추가하되, 염색되지 않은 튜브에 1x 결합 완충액 이상의 것은 추가하지 마십시오.
    9. RT에서 15분 동안 어두운 곳에서 튜브를 배양합니다.
    10. 모든 세포를 188 x g에서 RT와 디캔트 상층액에서 5분 동안 원심분리합니다.
    11. 400 μL의 1x binding buffer에 세포를 재현탁한 후 유세포분석으로 세포사멸을 위한 시료를 분석합니다. staining을 정확하게 표현할 수 있도록 튜브당 최소 10,000개의 이벤트를 수집합니다.
14. 접시에서 방사선 조사된 모든 세포를 50mL 코니컬 튜브와 펠릿 세포에 결합하고 RT에서 5분 동안 271 x g에서 원심분리합니다.
15. 흡인에 의해 튜브에서 상등액을 버리고 24mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 및 펠릿 세포에 실온에서 5분 동안 271 x g의 원심분리로 세포를 재현탁합니다.
16. 흡인에 의해 튜브에서 상등액을 버리고 IACUC에서 승인한 마우스를 투여하는 데 사용되는 PBS의 양만큼 세포를 재현탁합니다. 사용된 용량은 마우스당 5-10 x 10⁶ cells/50 μL 사이입니다. 따라서 10 마리의 마우스의 경우 500 μL에서 재현탁합니다 (각 용량의 세포 수는 방사선 조사를 위해 배양되는 세포 수에 따라 다름).
    메모: 피펫 팁 측면에 달라붙어 세포 손실을 초래할 수 있는 액체를 설명하기 위해 최소 2회 추가 투여하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Annexin V-FITC 키트	트레비겐	4830-250-케이	TACS Annexin V-FITC Kit를 사용하면 유세포분석을 사용할 때 개별 세포에서 세포사멸을 빠르고 특이적이며 정량적으로 식별할 수 있습니다.
BCL2 주르캣 T 세포	증권 시세	ATCC CRL-2899	BCL2 Jurkat 세포주는 인간 BCL-2 ORF 삽입물과 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pSFFV-neo 포유류 발현 벡터로 인간 Jurkat T 세포를 transfection하여 유래되었습니다. efferocytosis를 측정하는 모델이었습니다.
Countess II 자동 세포 계수기	써모피셔	AMQAX1000	이 플랫폼은 최첨단 광학 장치, 완전 자동 초점 및 이미지 분석 소프트웨어를 갖춘 벤치탑 분석 플랫폼으로, 현탁 세포를 신속하게 평가할 수 있습니다. 사용하기 매우 쉽습니다.
사이토스핀 4 세포원심분리기	써모피셔	A78300003	모든 액체 매트릭스, 특히 기관지폐포 세척액과 같은 저세포액으로부터 경제적인 박막 제제를 제공합니다.
Fetal Bovine Serum, 유자격, 열 비활성화	써모피셔	16140071	배양된 세포가 자랄 수 있도록 영양분을 제공합니다. 세포 배양의 표준입니다.
페니실린-스트렙토마이신	시그마/알드리치	P0781-100ML	페니실린-스트렙토마이신은 포유류 세포 배양에 가장 일반적으로 사용되는 항생제 용액입니다. 또한 세포 배양 중 무균 상태를 유지하는 데 사용됩니다.
RPMI 1640 배지, 글루타맥스 보충제	써모피셔	61870036	RPMI 1640 Medium(Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium)은 원래 인간 백혈병 세포를 현탁액 및 단층으로 배양하기 위해 개발되었습니다. RPMI 1640 배지는 HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, 성상세포, 암종 등 다양한 포유류 세포에 적합한 것으로 밝혀졌습니다. Jurkat T 세포가 빠르고 효율적으로 성장하도록 도와줍니다.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV 크로스링커	케임브리지 사이언티픽	16659	Stratalinker UV 가교제는 나일론, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 강화 니트로셀룰로오스 멤브레인에 세포사멸, 가교결합 DNA 또는 RNA를 유도하도록 설계되었습니다.

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