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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 시료 준비
- 9mL 헤파린 튜브에 말초 혈액을 수집하고 실험 프로토콜에 필요할 때까지 로터에서 샘플을 실온(RT)으로 유지합니다.
- 음성 대조군(튜브 2개), 양성 대조군(튜브 2개) 및 다양한 알레르기 유발 물질/약물 농도(테스트된 각 알레르기 유발 물질/약물 농도당 튜브 1개)에 대해 5mL 세포분석기 튜브에 라벨을 부착합니다. 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞는 랙에 튜브를 놓습니다.
- 2%(v/v) HEPES, 78mg/L NaCl, 3.7mg/L KCl, 7.8mg/L CaCl2, 3.3mg/L MgCl2, 1g/L HSA를 함유한 이중 증류수에 자극 완충액을 준비합니다. pH를 7.4로 조정하고 2ng/mL에서 IL-3를 추가합니다. 일반적으로 100mL를 준비하고 2.5mL 분취량으로 나누어 -20°C에서 동결합니다.
- PBS-Tween-20 0.05%(v/v)(PBS-T)에서 양성 대조군 준비: 호염기구의 품질을 확인하기 위해 양성 대조군 1, N-Formyl methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (4 μM); 양성 대조군 2, IgE 매개 양성 대조군으로서의 항-IgE(0.05mg/mL).
- 원하는 최종 농도의 2배에서 PBS-T의 알레르겐/약물을 준비합니다.
메모: 사용할 최적의 알레르겐/약물 농도는 광범위한 농도를 사용하고, 용량-반응 곡선에 의해, 동일한 프로토콜 단계에 따른 세포 독성 연구를 통해 사전에 결정해야 합니다.
2. 염색 혼합물 준비
- fluorochrome으로 라벨링된 단클론 항체를 제조업체가 권장하는 항체 농도에 따라 또는 이전의 항체 적정에 따라 자극 버퍼에 추가합니다. 이 프로토콜에서는 각 항체 1μL를 추가합니다(호염자 식별을 위한 CCR3-APC 및 CD203c-PE; 자극 buffer.
20μL당 호염병 활성화를 위한 CD63-FITC
메모: 염색 혼합물 제제를 빛으로부터 보호하십시오.
- 각 튜브에 23μL의 염색 혼합물을 추가합니다.
3. 혈액 자극
- 튜브 1 및 2(음성 대조군)에 PBS-T 100μL, 튜브 3에 fMLP 100μL, 튜브 4에 항IgE 100μL, 다양한 알레르겐/약물 농도 100μL를 다음 튜브에 추가합니다. 37 °C에서 10 분 동안 온도 조절 수조에서 시약을 미리 예열하기 위해 중간 교반으로 배양합니다.
- 용혈을 피하기 위해 각 튜브에 100μL의 혈액을 부드럽게 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 37°C에서 중간 교반으로 자동 온도 조절 수조에서 25분 동안 배양합니다.
- 탈과립을 중지하고 튜브를 최소 5분 동안 4°C로 유지합니다.
메모: 필요한 경우 프로토콜은 4°C에서 30-45분 동안 일시 중지할 수 있습니다.
4. 적혈구 용해
- 각 튜브에 2mL의 1x 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해합니다. 각 튜브를 소용돌이치고 RT.
에서 5분 동안 배양합니다.
메모: 이 단계에서는 완충액에 포함된 고정액(포름알데히드)으로 인해 세포가 고정됩니다.
- 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 디캔팅하여 랙을 싱크대로 뒤집습니다. 세포는 튜브의 바닥에 남아 있습니다.
- 각 튜브에 PBS-T 3mL를 첨가하여 세포를 세척합니다. 각 튜브를 소용돌이치십시오.
- 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 디캔팅하여 랙을 싱크대로 뒤집습니다.
메모: 유세포 분석기를 획득할 때까지 샘플을 4 °C로 유지하고 빛으로부터 보호하십시오.
5. 유세포 분석 획득
- 유세포 분석기(예: BD FACSCalibur 유세포 분석기)로 샘플을 획득합니다. 유세포 분석기를 컴퓨터 소프트웨어에 연결하고 세포 분석기가 준비될 때까지 기다립니다. 템플릿과 기기 설정을 로드합니다(표 1).
- 샘플 수집을 시작합니다.
- 활성화된 호염기구를 선택하기 위해 다음 세포분석기 전략을 사용하십시오.
- Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC) 플롯에서 림프구를 게이트합니다.
- 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3+CD203c+ 세포로 게이트합니다. 튜브당 최소 500개의 호염기구를 획득합니다.
- CD63을 활성화 마커로 사용하여 활성화를 분석하기 위해 CCR3 - CD63 플롯을 표시합니다. negative control tube를 사용하여 CD63 negative threshold를 약 2.5%로 설정합니다.
- 모든 샘플을 획득합니다.
표 1: 유세포 분석기 요구 사항
| 광원(레이저) | 488nm Coherent SapphireTM 공랭식 아르곤 이온 레이저; 20mW; 633nm JDS UniphaseTM HeNe 공랭식 레이저; 17mW |
| 광 여기 파장 | 블루 레이저 : 488 nm; 적색 레이저: 633nm |
| excitatory 파장에서의 광원 전력 | 블루 레이저: 20mW; 적색 레이저: 17mW |
| 광학 필터 | 증권 시세 표시기: 488/10; 핏츠: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20 |
| 광학 검출기 | FSC, SSC, FL1-H 핏츠, FL2-H PE, FL4-H APC |
| 광학 검출기 타이 | 공냉식 아르곤 이온 레이저 |
| 광학 경로 | BD 팔각형(488nm 레이저 라인); BD Trigons(633nm 레이저 라인) |