유세포 분석을 사용한 테스트 알레르겐이 있는 상태에서 호염병 활성화 분석

초록

출처: Doña, I. et al., 알레르기 진단을 위한 바소필 활성화 테스트. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 테스트 알레르겐이 있는 상태에서 호염 활성화를 평가하는 테스트를 시연합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 시료 준비

1. 9mL 헤파린 튜브에 말초 혈액을 수집하고 실험 프로토콜에 필요할 때까지 로터에서 샘플을 실온(RT)으로 유지합니다.
2. 음성 대조군(튜브 2개), 양성 대조군(튜브 2개) 및 다양한 알레르기 유발 물질/약물 농도(테스트된 각 알레르기 유발 물질/약물 농도당 튜브 1개)에 대해 5mL 세포분석기 튜브에 라벨을 부착합니다. 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞는 랙에 튜브를 놓습니다.
3. 2%(v/v) HEPES, 78mg/L NaCl, 3.7mg/L KCl, 7.8mg/L CaCl₂, 3.3mg/L MgCl₂, 1g/L HSA를 함유한 이중 증류수에 자극 완충액을 준비합니다. pH를 7.4로 조정하고 2ng/mL에서 IL-3를 추가합니다. 일반적으로 100mL를 준비하고 2.5mL 분취량으로 나누어 -20°C에서 동결합니다.
4. PBS-Tween-20 0.05%(v/v)(PBS-T)에서 양성 대조군 준비: 호염기구의 품질을 확인하기 위해 양성 대조군 1, N-Formyl methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (4 μM); 양성 대조군 2, IgE 매개 양성 대조군으로서의 항-IgE(0.05mg/mL).
5. 원하는 최종 농도의 2배에서 PBS-T의 알레르겐/약물을 준비합니다.
   메모: 사용할 최적의 알레르겐/약물 농도는 광범위한 농도를 사용하고, 용량-반응 곡선에 의해, 동일한 프로토콜 단계에 따른 세포 독성 연구를 통해 사전에 결정해야 합니다.

2. 염색 혼합물 준비

1. fluorochrome으로 라벨링된 단클론 항체를 제조업체가 권장하는 항체 농도에 따라 또는 이전의 항체 적정에 따라 자극 버퍼에 추가합니다. 이 프로토콜에서는 각 항체 1μL를 추가합니다(호염자 식별을 위한 CCR3-APC 및 CD203c-PE; 자극 buffer.
   20μL당 호염병 활성화를 위한 CD63-FITC 메모: 염색 혼합물 제제를 빛으로부터 보호하십시오.
2. 각 튜브에 23μL의 염색 혼합물을 추가합니다.

3. 혈액 자극

1. 튜브 1 및 2(음성 대조군)에 PBS-T 100μL, 튜브 3에 fMLP 100μL, 튜브 4에 항IgE 100μL, 다양한 알레르겐/약물 농도 100μL를 다음 튜브에 추가합니다. 37 °C에서 10 분 동안 온도 조절 수조에서 시약을 미리 예열하기 위해 중간 교반으로 배양합니다.
2. 용혈을 피하기 위해 각 튜브에 100μL의 혈액을 부드럽게 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 37°C에서 중간 교반으로 자동 온도 조절 수조에서 25분 동안 배양합니다.
3. 탈과립을 중지하고 튜브를 최소 5분 동안 4°C로 유지합니다.
   메모: 필요한 경우 프로토콜은 4°C에서 30-45분 동안 일시 중지할 수 있습니다.

4. 적혈구 용해

1. 각 튜브에 2mL의 1x 용해 완충액을 첨가하여 적혈구를 용해합니다. 각 튜브를 소용돌이치고 RT.
   에서 5분 동안 배양합니다. 메모: 이 단계에서는 완충액에 포함된 고정액(포름알데히드)으로 인해 세포가 고정됩니다.
2. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 디캔팅하여 랙을 싱크대로 뒤집습니다. 세포는 튜브의 바닥에 남아 있습니다.
3. 각 튜브에 PBS-T 3mL를 첨가하여 세포를 세척합니다. 각 튜브를 소용돌이치십시오.
4. 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 디캔팅하여 랙을 싱크대로 뒤집습니다.
   메모: 유세포 분석기를 획득할 때까지 샘플을 4 °C로 유지하고 빛으로부터 보호하십시오.

5. 유세포 분석 획득

1. 유세포 분석기(예: BD FACSCalibur 유세포 분석기)로 샘플을 획득합니다. 유세포 분석기를 컴퓨터 소프트웨어에 연결하고 세포 분석기가 준비될 때까지 기다립니다. 템플릿과 기기 설정을 로드합니다(표 1).
2. 샘플 수집을 시작합니다.
3. 활성화된 호염기구를 선택하기 위해 다음 세포분석기 전략을 사용하십시오.
   1. Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC) 플롯에서 림프구를 게이트합니다.
   2. 림프구 집단에서 호염기구를 CCR3⁺CD203c⁺ 세포로 게이트합니다. 튜브당 최소 500개의 호염기구를 획득합니다.
   3. CD63을 활성화 마커로 사용하여 활성화를 분석하기 위해 CCR3 - CD63 플롯을 표시합니다. negative control tube를 사용하여 CD63 negative threshold를 약 2.5%로 설정합니다.
   4. 모든 샘플을 획득합니다.

표 1: 유세포 분석기 요구 사항

광원(레이저)	488nm Coherent SapphireTM 공랭식 아르곤 이온 레이저; 20mW; 633nm JDS UniphaseTM HeNe 공랭식 레이저; 17mW
광 여기 파장	블루 레이저 : 488 nm; 적색 레이저: 633nm
excitatory 파장에서의 광원 전력	블루 레이저: 20mW; 적색 레이저: 17mW
광학 필터	증권 시세 표시기: 488/10; 핏츠: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
광학 검출기	FSC, SSC, FL1-H 핏츠, FL2-H PE, FL4-H APC
광학 검출기 타이	공냉식 아르곤 이온 레이저
광학 경로	BD 팔각형(488nm 레이저 라인); BD Trigons(633nm 레이저 라인)

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 캡 없음, 비멸균	코 닝	352008
APC anti-human CD193 (CCR3) 항체	바이오레전드	310708
BD FACS칼리버 유세포 분석기	BD 바이오사이언스
염화칼슘	시그마-알드리치	C1016
FITC anti-human CD63 항체	바이오레전드	353006
헤페스 (1M)	써모 피셔	15630106
용해 용액 10x 농축	BD 바이오사이언스	349202
염화마그네슘	시그마-알드리치	M8266
N-포르밀-메트-레우-페	시그마-알드리치	F3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) 항체	바이오레전드	324606
염화칼륨	시그마-알드리치	P9541
정제된 마우스 항인간 IgE	BD 바이오사이언스	555857
재조합 인간 IL-3	R&D 시스템	203-일리노이
시스 플루이드	BD 바이오사이언스	342003
소금	시그마-알드리치	S3014
TUBE 9mL LH 리튬 헤파린	Greiner 바이오 원	455084
트윈 20	시그마-알드리치	P1379

(영문) (영문)