박테리아에 감염된 형질전환 제브라피시의 광변환 기반 백혈구 추적

초록

출처: Harvie, E. A. et al., 연쇄상구균 감염의 제브라피시 유충 모델에서 선천적 면역 반응의 비침습적 이미징.J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 광전환 가능한 녹색 형광 단백질을 발현하는 형질전환 제브라피시 유충을 사용하여 백혈구 동원을 추적하는 방법을 보여줍니다. 적색 형광 염료 표지 박테리아를 이낭에 사전 주입하고 광변환을 유도하면 백혈구의 이동, 식균작용 및 몸 전체의 분산을 관찰할 수 있어 면역 반응 역학에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

1. 마이크로 주입 바늘 준비

1. 공기 압력 200, 열 502, 당김 90, 속도 80, 시간 70, 당김 5 시작 시 공기 시간, 당김 5 종료 시 공기 시간.
2. 가는 핀셋을 사용하여 당긴 바늘의 끝을 잘라 팁 구멍의 직경이 약 10μm가 되도록 합니다.

2. 애벌레 주입 접시 준비

1. 레인 너비가 약 4-5mm인 젤 빗을 멸균수로 헹구고 건조시킵니다.
2. E3 배지에 1.5-2% 고용융 아가로스 용액을 준비하고 용액이 투명해질 때까지 전자레인지에 넣습니다. 식으면 아가로스 중 일부를 페트리 접시(100 x 15mm)에 붓고 접시 바닥을 완전히 덮을 만큼만 아가로스를 추가하여 소용돌이칩니다.
3. 아가로스 층이 굳으면 헹구고 건조시킨 젤 빗을 그 위에 올려 빗질하지 않은 끝이 페트리 접시 위에 놓이고 빗질 끝이 아가로스에 닿도록 합니다. 빗이 가능한 한 수평이 되어 바닥 아가로스 층에 대해 30° 각도를 생성하는지 확인하십시오.
4. 빗과 바닥 아가로스 층 사이의 경계면에 소량의 아가로스를 추가로 부어 신선한 아가로스 층이 빗의 우물을 덮도록 합니다. 빗을 제거하기 전에 완전히....

결과

그림 1: S. iniae를 동반한 이낭 감염에 대한 백혈구 동원.(A) S. iniae 감염에 대한 호중구 동원. (i) 이낭에 페놀 적색 표지 접종물을 성공적으로 주입합니다. (II-IV) 수단 2 hpi에서 호중구 모집 조사를 위한 유충의 검은색 염색. PBS 모의 감염 유충은 이낭에 호중구가 거의 동원되지 않는 반면(ii), 야생형 S. iniae 또는 cpsA 돌연변이에 감염되면 강력한 호중구 동원이 발생합니다(iii, iv). 눈금 막대.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.7 ml 에펜도르프	미드사이	AVSS1700
14ml 팔콘 튜브	BD 팔콘	352059
96웰 플레이트	코닝 주식회사	3596
한천	BD 바이오사이언스	214030
셀트래커 레드	분자 프로브, Invitrogen	C34552
CNA 한천	닷 사이언티픽, Inc	7126ᅡ
일회용 이송 피펫	피셔 사이언티픽	13-711-7엠
내시경 해부	니콘	SMZ745
디엠소	시그마 알드리치	D2650
가는 핀셋	정밀 과학 도구	11251-20
젤 빗	폭스바겐	27372-482	폭 4.2mm, 두께 1.5mm
유리 바닥 접시			35mm 조직 배양 접시 바닥 중앙에 16-18mm 구멍을 뚫고 구멍에 22mm 원형 #1 커버슬립을 놓고 자외선에 의해 경화된 Norland Optical Adhesive 68의 얇은 층으로 밀봉하여 맞춤 제작되었습니다.
글리세롤	피셔 사이언티픽	사33-4
고용융 아가로스	덴빌 사이언티픽, Inc.	CA3510-6
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	올림푸스	FV-1000 시스템 사용
저용융 아가로스	어부	BP165-25
마그네틱 스탠드	트라이텍(나리시게)	GJ-1
미세주입 시스템	파커	피코스프리처 III
Microloader 피펫 팁	에펜도르프	930001007
마이크로 매니퓰레이터	트라이텍(나리시게)	엠-152
마이크로피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 컴퍼니	플레밍/브라운 P-97
Nanodrop 분광광도계	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	ND-1000
N-페닐티오우레아(PTU)	시그마 알드리치	P7629
Paraformaldheyde	전자 현미경 과학	15710
페트리 접시	피셔 사이언티픽	FB0875712	100mm x 15mm
페놀 레드	리카 화학 회사	572516
인산염 완충 식염수	피셔 사이언티픽	BP665-1
프로나제	로슈	165921
프로테아제 펩톤	플루카 바이오케미카	29185
스몰 세포 배양 접시	코닝 주식회사	430165	35mm x 10mm
얇은 벽 유리 모세관 주사 바늘	월드 정밀 기기, Inc.	TW100-3
토드 휴이트	Sigma Aldrich/Fluka 분석	T1438
트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트)	은빛 화학 연구소 / Finquel	C-핀크-UE-100G
효모 추출물	플루카 바이오케미카	92144

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