$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 마이크로 주입 바늘 준비
- 공기 압력 200, 열 502, 당김 90, 속도 80, 시간 70, 당김 5 시작 시 공기 시간, 당김 5 종료 시 공기 시간.
- 가는 핀셋을 사용하여 당긴 바늘의 끝을 잘라 팁 구멍의 직경이 약 10μm가 되도록 합니다.
2. 애벌레 주입 접시 준비
- 레인 너비가 약 4-5mm인 젤 빗을 멸균수로 헹구고 건조시킵니다.
- E3 배지에 1.5-2% 고용융 아가로스 용액을 준비하고 용액이 투명해질 때까지 전자레인지에 넣습니다. 식으면 아가로스 중 일부를 페트리 접시(100 x 15mm)에 붓고 접시 바닥을 완전히 덮을 만큼만 아가로스를 추가하여 소용돌이칩니다.
- 아가로스 층이 굳으면 헹구고 건조시킨 젤 빗을 그 위에 올려 빗질하지 않은 끝이 페트리 접시 위에 놓이고 빗질 끝이 아가로스에 닿도록 합니다. 빗이 가능한 한 수평이 되어 바닥 아가로스 층에 대해 30° 각도를 생성하는지 확인하십시오.
- 빗과 바닥 아가로스 층 사이의 경계면에 소량의 아가로스를 추가로 부어 신선한 아가로스 층이 빗의 우물을 덮도록 합니다. 빗을 제거하기 전에 완전히 식히십시오. 피펫 팁을 사용하여 우물에서 돌출된 아가로스 조각을 제거합니다.
- 사출 금형 위에 E3 매체를 붓고 4 ° C에서 보관하십시오.
- 매번 사용하기 전에 주입 전 최소 한 시간 동안 28.5°C에서 새로운 중온 주입 램프로 교체하십시오.
- 주사 직전에 주사 램프의 E3를 200μg/ml 에틸 3-아미노벤조에이트(트리카인)가 함유된 E3 배지로 교체합니다.
3. 연쇄상 구균 iniae (S. iniae) 접종 준비
- 0.2% 효모 추출물과 2% 프로테오스 펩톤(THY+P)이 보충된 Todd Hewitt 육수 배지를 준비하고 오토클레이브합니다: 30g/L Todd Hewitt, 2g/L 효모 추출물, 20g/L 프로테오스 펩톤. 한천 플레이트의 경우 14g/L 한천을 추가합니다.
- 밀봉된 15ml 튜브에 10ml의 THY+P 육수에 100μl의 냉동 박테리아 스톡 분취액을 피펫팅하여 감염 전날 밤에 박테리아 배양을 준비합니다. 37 °C에서 교반 없이 밤새 배양합니다. 14-16 시간의 성장 후, 하룻밤 배양을 사용하여 냉동고 재고를 만들거나 주사에 사용할 준비
를하십시오.
- 1.7ml 원심분리기 튜브에 500μl의 80% 글리세롤에 하룻밤 배양 1ml를 넣어 냉동고 재고를 만듭니다. 동결-해동 주기를 방지하려면 이 혼합물에서 100μl의 일회용 부분 표본을 만들어 -80°C에서 보관하십시오.
- 감염에 사용되는 S. iniae의 경우, THY+P 육수 9.9ml에 익일배양 0.1ml를 첨가하여 하룻밤 배양액을 1:100으로 희석하여 총 10ml 배양액을 만듭니다. 37 ° C에서 약 4-5 시간 동안 교반 없이 성장합니다. Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 600nm에서 광학 밀도(OD)를 모니터링하고 OD600 nm가 0.250-0.500에 도달할 때 중간 대수 단계에서 박테리아를 수확합니다. 0.250의 OD600 nm는 약 108 집락 형성 단위(CFU)/ml에 해당합니다.
- 1.7ml 원심분리 튜브에 1ml의 박테리아 배양액을 1,500 x g으로 5분 동안 펠렛으로 만들고 신선한 인산염 완충 식염수(PBS) 1ml에 재현탁하고 반복합니다. PBS에서 박테리아의 OD600 nm를 측정하고, 펠릿을 측정하고, PBS에서 재현탁하여 원하는 농도를 달성합니다.
- 미세주입의 시각화를 돕기 위해 주입 전에 박테리아 현탁액에 페놀 레드를 첨가하여 최종 농도를 0.1%로 만듭니다.
- 열에 의해 죽인 박테리아의 주입과 관련된 실험의 경우, PBS의 박테리아를 95°C에서 30분 동안 가열합니다.고체 THY+P 한천 플레이트에 주입량(약 1nl)을 도금하고 37°C에서 밤새 배양하여 열 죽이기 공정이 생존 가능한 박테리아의 수를 검출할 수 없는 수준으로 감소시켰는지 확인합니다.
4. CellTracker Red Fluorescent Dye로 S. iniae 라벨링
- 살아있는 박테리아 세포를 라벨링하려면 CellTracker 형광 염료 또는 이와 동등한 원액을 준비합니다. 사용된 염료는 20 x 50 μg의 분취량으로 제공되며 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 재현탁해야 하므로 튜브에 7.3 μl DMSO를 첨가하여 10mM의 스톡 농도를 얻습니다.
- 박테리아에 대한 다양한 염료 농도(예: 0.5-25 μM)를 테스트하여 세포를 염색하는 가장 낮은 최적 농도를 결정합니다. 세포가 빠르게 분열하고 실험이 길면 더 높은 농도의 염료가 필요할 수 있습니다.
- 위에서 설명한 대로 원심분리하여 1.7ml 튜브에 1.0ml의 박테리아 배양액을 펠렛화합니다(섹션 3). 펠릿을 1ml의 신선한 PBS에 재현탁시키고 박테리아 배양액에 적절한 양의 염료를 첨가합니다.
- 37 ° C에서 30 분 동안 교반 없이 배양합니다. 박테리아를 회전시키고 예열 된 THY + P 육수 1ml에 재현탁하고 37 ° C에서 30 분 동안 추가로 교반없이 배양합니다.
- 위에서 설명한 대로 OD600 nm를 측정하고 미세 주입을 위해 박테리아를 희석하기 전에 박테리아를 스핀다운하고 PBS에서 두 번 세척합니다(섹션 3). 우리는 일반적으로 백혈구 모집 및 식세포작용 연구를 위해 1nl 주입량에 약 100CFU를 주입합니다.
5. 제브라피시 유충의 감염 준비
- 전날 밤에 번식 쌍을 설정하고 Rosen et al.이 설명한 대로 배아를 수집합니다.감염 준비가 될 때까지 28.5°C에서 E3 배지로 배아를 배양합니다.
- 이미징할 제브라피쉬의 경우, 최종 농도 0.2nM의 hpf(수정 후 24시간)에서 E3 배지에 N-Phenylthiourea(PTU)를 추가하여 색소(멜란화)의 발생을 방지합니다.
- 수정 후 2일 된 배아(dpf)와 관련된 감염의 경우, 한 쌍의 미세한 핀셋으로 수동으로 배아를 탈도금합니다. 또는 E3를 제거하고 프로나제(pronase, 2mg/ml)로 대체하여 약 5분 동안 또는 부드러운 피펫팅으로 융모막에서 배아를 분리할 때까지 배아를 탈피합니다. 대부분의 유충은 3dpf까지 자연적으로 부화해야 합니다.
- 감염되기 몇 분 전에 제브라피쉬를 200μg/ml 트리카인이 함유된 E3 배지에 넣어 마취합니다.
6. 3일 된 유충에 S. iniae의 이낭 주입
- 마이크로인젝터를 켜고 시간 범위를 "밀리초"로 설정합니다. 이산화탄소 탱크의 밸브를 열어 가스를 라인으로 유입시킵니다. 마이크로인젝터의 압력은 약 20PSI(제곱인치당파운드)를 읽어야 합니다. 검은색 knurled 손잡이를 시계 방향으로 돌려 압력을 높이거나 시계 반대 방향으로 돌려 압력을 낮추십시오.
- 준비된 S. iniae 배양을 페놀 레드 및 PBS로 볼텍스하고 마이크로로더 팁을 사용하여 배양액 2-3μl를 당겨진 모세관 주사 바늘에 로드합니다.
- 장전된 바늘을 자기 스탠드에 연결된 미세 조작기에 장착하고 바늘이 현미경 바닥에 대해 약 45-65° 각도가 되도록 실체 현미경 아래에 놓습니다.
- 마이크로인젝터의 풋 페달을 눌러 바늘 끝에 접종물 한 방울을 떨어뜨립니다. 현미경의 접안렌즈에 있는 눈금 막대를 사용하여 방울의 직경을 측정합니다.
- 또는 눈금 막대가 있는 유리 현미경 슬라이드의 미네랄 오일 한 방울에 부피를 주입하여 방울의 직경을 추정합니다. 방울의 직경은 약 0.10mm여야 하며, 이는 약 1nl 부피입니다.
- 마이크로인젝터의 지속 시간 설정을 조정하거나 미세한 핀셋으로 바늘 끝을 더 많이 잘라내어 입자 크기를 조정합니다. 주입 시간은 너무 많은 조직 손상을 방지하기 위해 20 - 35 msec 사이여야 합니다.
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 마취된 유충 12마리를 사출 금형의 각 웰로 옮깁니다.
- 유리 막대, 머리카락 고리 또는 플라스틱 팁을 사용하여 머리가 현미경 뒤쪽을 향하고 노른자 주머니가 우물의 왼쪽에 오도록 유충을 부드럽게 배치합니다. 유충의 왼쪽 귀를 천장 쪽으로 향하게 합니다.
- 실체현미경의 안구 렌즈를 통해 보면서 미세 조작기의 손잡이를 사용하여 장전된 바늘을 이낭과 정렬하여 둘 다 동일한 시야에 있도록 합니다. 바늘 끝으로 이낭의 바깥쪽 상피층을 뚫어 바늘 끝이 소포 바로 안쪽에 오도록 합니다.
- 풋 페달을 밟아 원하는 용량의 S. iniae 1nl을 주입합니다. 캐비티가 파열되지 않도록 충분히 낮은 압력을 사용하십시오. 주사가 성공적이면 주변 조직이 아닌 귀 소포가 페놀 적색 접종물로 채워져야 합니다(그림 1 Ai). 주입 플레이트에서 잘못 주입된 물고기를 즉시 제거하십시오.
- 유충에서 바늘을 조심스럽게 집어넣고 다음 유충이 보이도록 주입 플레이트를 손으로 움직입니다. 5X 배율에서 이 작업을 수행합니다.
메모: 바늘을 집어넣으면 일부 박테리아가 이낭 외부에 침착될 수 있으며, 이로 인해 생존 및 백혈구 모집 결과가 왜곡될 수 있습니다. 이를 방지하려면 형광 염료 표지 박테리아를 주입하고 주입된 유충을 형광 현미경으로 육안으로 스캔하여 이러한 현상이 발생한 유충을 제거하는 것이 좋습니다. 올바르게 주입된 유충은 (그림 1 Bi)에 나와 있습니다.
- 실험 과정 동안 주입량/접종량이 동일하게 유지되도록 하려면 48번째 배아마다 100μl의 멸균 PBS가 들어 있는 1.7ml 원심분리 튜브에 박테리아 현탁액 한 방울을 주입합니다. THY+P 한천 플레이트에 100μl를 하룻밤 동안 37°C에서 플레이트하여 주입량의 CFU를 측정합니다.
- 주입 램프에있는 12 마리의 유충 그룹 전체가 주입되면 플라스틱 이송 피펫을 조심스럽게 사용하여 우물에서 유충을 제거하고 새 페트리 접시 (35 x 10 mm2)에 넣습니다. 트리카인 용액을 제거하고 약 2ml의 새로운 E3 배지로 교체하여 유충이 회복할 수 있도록 합니다.
- 피펫은 96웰 플레이트의 단일 웰에 유충을 주입하고 28.5°C에서 배양했습니다. 이 플레이트에서 생존을 위해 시간이 지남에 따라 유충을 모니터링하거나 나중에 이미징 또는 CFU 계수를 위해 제거합니다.
7. 이미징을 위한 유충 고정
- 섹션 7에 설명된 대로 PBS 용액의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드에 유충을 고정합니다.
- 실온에서 이미징하기 전에 PBS에서 각각 5분씩 3회 세척합니다.
8. 라이브 이미징을 위한 유충 준비
- E3에서 1.5% 저융점 아가로스 용액을 용액이 투명해질 때까지 전자레인지에서 가열하여 준비합니다.
- 아가로스 용액을 55°C 수조에 넣어 식히되 굳지 않도록 합니다.
- 아가로스에 트리카인을 첨가하여 최종 농도 0.016%를 달성합니다.
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 마취된 유충 4-5마리를 실체현미경 스테이지의 유리 바닥 접시에 놓습니다.
- 55°C 수조에서 트리카인과 아가로스 용액을 제거하고 실온에서 1-2분 동안 식힙니다. 아가로스가 식는 동안 마취된 유충에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.
- 냉각된 아가로스를 표면의 절반 정도가 덮일 때까지 접시에 붓습니다. 접시를 휘젓어 아가로스를 펼칩니다. 아가로스가 너무 뜨거우면 유충이 죽습니다. 또한 접시에 아가로스를 너무 많이 넣으면 아가로스를 통해 초점을 맞출 때 현미경의 대물 렌즈가 접시 바닥에 부딪힐 수 있습니다.
- 전사 피펫을 사용하여 접시 옆으로 떠다니는 유충을 집어 중앙으로 다시 피펫으로 넣습니다.
- 실체 현미경 아래에서 헤어 루프, 긴 피펫 팁 또는 유리 막대를 사용하여 원하는 대로 유충을 부드럽게 배치합니다. 이낭(otic vesicle)을 촬영하려면 왼쪽 귀 소포가 접시 바닥에 평평하게 놓이도록 유충을 배치합니다.
- 접시를 옮기기 전에 아가로스를 약 10분 동안 식히십시오. 유충은 아가로스가 단단하지 않으면 위치를 바꿀 수 있습니다. 트리카인과 E3 용액을 아가로스 층 상단에 부드럽게 피피펫으로 발라 촉촉하게 유지합니다.
9. 감염의 컨포칼 이미징
- 유충이 있는 유리 바닥 접시를 무대에 놓습니다.tagFV-1000 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템이 있는 도립 현미경의 e.
- 핀홀을 200-300μm로 설정하고 숫자 조리개 0.75/20X 대물 렌즈를 사용하여 3-6μm 슬라이스로 z-스택을 설정합니다.
- 연속 라인 스캔을 사용하여 각 채널의 레이저 출력과 검출기 게인을 조정합니다.
- 각 형광 채널(예: 488 및 543nm)에 대한 순차 라인 스캐닝과 미분 간섭 대비(DIC)를 사용하여 2-6시간 동안 3분마다 왼쪽 귀 소포의 타임 랩스 동영상을 수행하여 호중구 및 대식세포에 의한 초기 모집 및 식세포작용을 관찰합니다. 더 긴 시간 코스의 경우 페트리 접시에 뚜껑을 덮어 아가로스의 증발과 건조를 방지하십시오.
- 고정(그림 1B) 또는 살아있는(그림 2) 유충의 정지 이미지를 20X 또는 40X 배율로 획득합니다.
10. 이삭 소포에서 Dendra2 표지 백혈구의 광변환
참고: Dendra2는 관심 영역(ROI)에 405nm 레이저(50-70% 레이저 출력이 충분해야 함)를 1분 동안 집중시켜 녹색에서 적색 형광으로 광변환할 수 있습니다. 다음은 FV-1000 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템에 사용되는 단계별 프로토콜입니다.
- 488nm 및 543nm 레이저를 사용한 z-stack 스캔을 사용하여 샘플을 시각화합니다. 연속 라인 스캔을 사용하여 레이저 출력과 검출기 게인을 조정합니다. 실수로 광변환된 적색 형광이 없는지 확인하십시오.
- "Image Acquisition Control" 창의 "Stimulus Setting"에서 "Use Scanner" 도구를 선택하고 "Main"을 선택합니다. 405nm 레이저를 선택하고 70% 전력으로 설정합니다. circle 옵션을 사용하여 귀 소포의 ROI를 정의합니다.
- "Stimulus Start Setting"에서 사전 활성화가 1프레임이고 활성화 시간이 60,000msec인 "Activation in series"를 선택합니다. "Time Scan 제목" 아래의 "Acquisition Setting" 창에서 00:01:00 간격 2개(사진 변환 전과 사후 사진 변환)를 선택합니다.
메모: 타임랩스 시리즈 스캔이 완료된 후 Dendra2는 적색 형광 상태로 광변환되어야 합니다.
- 488nm 및 543nm 레이저를 사용하여 z-스택으로 샘플을 스캔하여 광변환된 적색 형광과 남아 있는 녹색 형광을 시각화합니다(그림 3).
