림프구 아형(Lymphocyte subtype)을 특성화하기 위한 3차원 정량적 위상 이미징(Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging)

초록

출처: Yoon, J. et al. Label-Free Identification of Lymphocyte subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. 특급.(2018년)

이 비디오는 3D 정량적 위상 이미징을 통해 림프구 형태 및 생화학을 표지 없이 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 림프구를 철저히 분석하여 라벨링 절차 없이 림프구의 내부 구조와 특성을 밝힐 수 있습니다.

프로토콜

1. 유세포 분석 및 림프구 아형 분류

참고: 세포 유형에 따라 림프구를 정렬하는 것은 지도 학습에서 세포 유형 분류기를 훈련하고 테스트하기 위한 실측 자료(즉, 올바른) 세포 유형 레이블을 설정하는 데 필수적입니다. 황금 표준 방법인 유세포 분석법은 림프구를 식별하고 분리하는 데 사용됩니다.

1. B, CD4⁺ T 및 CD8⁺ T 림프구를 표적으로 하기 위해 100μg의 새로운 RPMI-1640 배지[10% FBS, 0.1μg의 CD3e(17A2), CD8a(53-6.7), CD19(1D3), CD45R(B220, RA3-6B2) 및 NK1.1(PK136) 포함] 및 0.25μg의 CD4(GK1.5) 항체에 표면 마커 염색 항체를 혼합합니다.
2. 항체 혼합물 100μL를 세포 현탁액에 추가합니다.
3. 얼음 위에서 25분 동안 배양합니다.
4. PBS 5mL를 첨가하고 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 2회 원심분리하여 세포를 세척합니다.
5. 10% FBS 및 2.5μg의 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)가 포함된 5mL의 새로운 RPMI-1640 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
6. 위에서 설명한 마커의 형광 수준을 사용하여 유세포 분석으로 각 림프구 유형을 개별적으로 수집합니다. DAPI 신호를 사용하여 죽은 세포를 동시에 제외합니다.

2. 3D 정량적 위상 이미징

1. 이미징 절차 내내 분류된 림프구를 얼음 위에 보관하며, 세포 손상 및 생화학적 변화를 방지하기 위해 5시간 이내(마우스에서 림프구 분리 이후)를 완료해야 합니다.
2. 정렬된 세포 유형(B, CD4⁺ T 및 CD8⁺ T 림프구 중)을 선택하고 최적의 이미징 조건(즉, 단일 시야당 1개의 세포)을 위해 RPMI 배지를 사용하여 샘플을 180 cells/μL로 희석합니다.
3. 120 μL의 희석된 샘플을 느린 주입으로 이미징 챔버에 로드합니다. 샘플과 함께 이미징 챔버에 기포가 있는지 철저히 확인합니다. 기포가 있으면 측정 품질이 저하되므로 조심스럽게 제거하십시오.
4. 상용 3D 정량 위상 현미경 또는 홀로토모그래피와 이미징 소프트웨어를 사용하여 3D RI 단층촬영을 획득합니다.
   참고: 실험 설정에 대한 자세한 정보는 원본 원고에서 찾을 수 있습니다.
   1. 현미경의 대물 렌즈 위에 증류수 한 방울을 떨어뜨립니다.
   2. 샘플과 함께 이미징 챔버를 현미경의 translation stage에 놓고 샘플이 대물 렌즈와 정렬되도록 위치를 조정합니다.
   3. 이미징 소프트웨어의 "Microscope" 투시의 "Calibration" 탭에서 Focus와 Surface를 각각 클릭하여 대물 렌즈와 콘덴서 렌즈의 축 위치를 조정합니다.
   4. Auto Mode를 클릭하여 대물렌즈와 콘덴서 렌즈를 정렬합니다. 또는 스캐닝 모드를 사용하여 렌즈를 수동으로 조정하여 조명 패턴이 시야의 중앙 영역에 국한되도록 합니다.
   5. 일반 모드로 돌아가 변환 단계를 조정하여 시야에서 셀을 찾습니다.
   6. 대물렌즈의 축 위치를 조정하여 초점면을 찾습니다. 완벽한 초점은 화면에 시각화된 샘플 경계를 거의 보이지 않게 합니다.
   7. 셀이 없는 위치를 찾도록 변환 단계를 조정합니다.
   8. 보정을 클릭하여 다양한 조명 각도로 여러 2D 홀로그램을 측정합니다.
   9. 평행 이동 단계를 조정하여 시야의 중앙에 셀을 배치합니다.
   10. "획득" 탭으로 이동하고 3D 스냅샷을 클릭하여 2.4.8단계와 동일한 조명 각도로 셀의 홀로그램을 측정합니다.
   11. 수집된 데이터가 "Data Management" 패널에 표시되면 수집된 데이터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 프로세스를 클릭하여 이미징 소프트웨어에 구현된 회절 단층 촬영 알고리즘을 사용하여 2.4.8 및 2.4.10 단계에서 측정된 홀로그램에서 3D RI 단층촬영을 재구성합니다.
   12. 2.4.5-2.4.11단계를 반복하여 100개 이상의 셀을 측정하여 기계 학습에 대한 통계적 검정력을 보장합니다.
   13. 2.4.11단계를 통해 처리된 모든 이미지를 시각화할 수 있습니다. "Data Management" 패널에서 데이터를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Open(열기)을 클릭하여 데이터를 시각화합니다. "Data Manager(데이터 관리자)" 패널에서 RI 단량도를 클릭합니다. "Preset" 탭에서 Load를 클릭하고 "lymphocyte.xml"를 두 번 클릭하는데, 이는 3D RI 분포에 따라 단층 촬영을 시각화하기 위해 이미징 소프트웨어에서 제공하는 사전 정의된 전달 함수입니다.
5. 2.2-2.4단계를 반복하여 모든 림프구 아형의 3D RI 단층촬영을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유세포 분석	BD 바이오사이언스	아리아 II 또는 III
이미징 챔버	주식회사 토모큐브	토모디쉬
홀로모그래피	토모큐브, Inc	하트-1H
홀로토모그래피 이미징 소프트웨어	주식회사 토모큐브	토모스튜디오
이미지 처리 소프트웨어	매스웍스	매트랩 R2017b
Falcon 원추형 원심분리기 튜브	써모피셔 사이언티픽	14-959-53ᅡ	15 밀리리터
인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	806544-500ML
암모늄-염화물-칼륨 용해 완충액	써모피셔 사이언티픽	A1049201
RPMI-1640 배지	시그마-알드리치	R8758
소 태아 세럼	써모피셔 사이언티픽	10438018