혈액에서 자성 유리 입자 매개 핵산 추출 기법

초록

출처: Rosenstierne, M. W., et al. 전혈 샘플에서 바이러스 검출을 위한 빠르고 안전하며 간단한 수동 병상 핵산 추출. J. Vis. 특급. (2018).

이 동영상은 실리카로 코팅된 작은 자성 구슬인 자성 유리 입자(MGP)를 사용하여 전혈에서 핵산을 추출하는 기술을 보여줍니다. 용해 완충액을 사용하여 혈액 세포를 용해시키면 방출된 핵산이 실리카로 코팅된 MGP의 표면에 결합하여 샘플에서 분자를 추출합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 환자의 혈액 채취

주의: 환자로부터 전혈을 채취할 때 적절한 실험실 안전 조치를 취하십시오. 장갑과 안경을 착용하십시오. 환자가 격리되어 있는 경우 생물 안전성 레벨 4 절차를 따르십시오.

1. 환자로부터 정맥 주사 전혈을 채취하려면 소구경 확장 튜브가 있는 버터플라이 바늘과 용해/결합 완충액이 들어 있는 채혈 진공관을 사용합니다. 환자의 팔을 아래쪽 위치에 놓고 채취 튜브를 나비 바늘보다 낮게 놓습니다. 나비 바늘을 환자의 정맥에 삽입하고 채혈 진공관을 소구경 확장에 부착합니다.
   메모: 이렇게 하면 역류를 방지할 수 있습니다.
2. 채혈 후 튜브를 5 - 10회 뒤집어 튜브의 내용물을 섞습니다.
   메모: 1.6mL의 용해/결합 완충액이 들어 있는 채혈 튜브에 진공이 남아 있기 때문에 수집된 샘플의 부피는 자동으로 1.6mL가 됩니다.
3. 70% 에탄올을 사용하여 튜브 외부를 소독합니다.
4. 실온에서 20분 동안 튜브를 배양합니다.
   메모: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 전체 채혈 튜브는 -20°C, 5°C, 25°C 또는 37°C에서 최소 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
5. 간소화된 NA 추출 방법으로 바로 진행합니다.

2. 전혈의 단순화 된 NA 추출

1. 용해/결합 완충액으로 불활성화된 채취된 혈액에서 NA를 정제하려면 진공관을 손으로 5 - 10회 뒤집어 튜브의 내용물을 혼합합니다.
2. 튜브의 뚜껑을 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 배출하십시오.
3. 준비된 MGP의 부분 표본(1mL)을 채혈 튜브에 직접 붓습니다.
4. 사용하지 않은 채혈 튜브의 새 뚜껑을 샘플이 들어 있는 튜브에 놓습니다.
5. 뚜껑에 손가락을 올려 튜브가 단단히 닫혔는지 확인하고 채혈 튜브를 손으로 5-10회 뒤집어 튜브의 내용물을 섞습니다.
6. 튜브를 마그네틱 홀더에 넣고 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.
7. 튜브가 있는 마그네틱 홀더를 손으로 몇 번 뒤집어 모든 MGP가 자석이 있는 튜브 측면에 모였는지 확인합니다.
   메모: 마그네틱 홀더는 길쭉한 자석과 고무 밴드로 교체할 수 있습니다.
8. 튜브의 뚜껑을 제거하고 일회용 피펫을 사용하거나 내용물을 50mL 수집 튜브에 부어 튜브의 내용물을 버립니다.
   메모: 50mL 수집 튜브에서 에어로졸이 나오지 않도록 하려면 뚜껑을 닫아 주십시오.
9. 준비된 세척 버퍼-1(WB-1, 4mL)의 분취액을 채혈관에 직접 붓습니다.
10. 튜브에 뚜껑을 놓고 뚜껑에 손가락을 올려 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.
11. 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거하고 손가락으로 뚜껑을 단단히 조입니다.
    메모: 자석과 고무 밴드를 사용하는 경우 튜브에서 고무 밴드와 자석을 제거하기만 하면 됩니다.
12. 채혈 튜브를 손으로 5 - 10회 뒤집어 MGP를 다시 매달아 놓습니다.
13. 2.6 - 2.8단계를 반복합니다.
14. 준비된 WB-2(1.5mL)의 부분 표본을 채혈 튜브에 직접 붓습니다.
15. 튜브에 뚜껑을 놓고 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거합니다.
    메모: 자석과 고무 밴드를 사용하는 경우 튜브에서 고무 밴드와 자석을 제거하기만 하면 됩니다.
16. 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.
17. 손으로 채혈 튜브를 몇 초 동안 뒤집어 MGP를 다시 부유시킵니다.
18. 2.6 - 2.8단계를 반복합니다.
19. 준비된 WB-3(3mL)의 부분 표본을 채혈 튜브에 직접 붓습니다.
20. 튜브에 뚜껑을 놓고 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거합니다.
    메모: 자석과 고무 밴드를 사용하는 경우 튜브에서 고무 밴드와 자석을 제거하기만 하면 됩니다.
21. 뚜껑에 손가락을 대고 튜브가 단단히 닫혔는지 확인합니다.
22. 채혈 튜브를 손으로 5 - 10회 뒤집어 MGP를 다시 매달아 놓습니다.
23. 2.6 - 2.8단계를 반복합니다.
24. 준비된 용리 완충액(EB, 100 μL)의 분취액을 채혈 튜브에 직접 붓습니다.
25. 튜브에 뚜껑을 놓고 마그네틱 홀더에서 튜브를 제거합니다.
    메모: 자석과 고무 밴드를 사용하는 경우 튜브에서 고무 밴드와 자석을 제거하기만 하면 됩니다.
26. 손가락으로 채혈관을 5 - 10회 두드려 EB에 MGP를 다시 매달아 놓습니다.
    메모: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 튜브는 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
27. 1.5mL 일회용 피펫을 사용하여 재현탁된 MGP의 한 방울(5 - 8 μL)을 다운스트림 NA 증폭 반응 혼합물로 옮깁니다(루프 매개 등온 증폭(LAMP)/역전사 램프(RT-LAMP) 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)/RT-qPCR 분석과 같은 다운스트림 진단 NA 증폭 분석법을 사용할 수 있음).
    메모: NA는 MGP에 달라붙으므로 다운스트림 NA 증폭 반응에서 MGP를 사용해야 합니다. 사용하기 전에 MGP 서스펜션을 혼합하십시오. 혼합 후 MGP는 튜브 바닥에 모입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Vacutainer K2 EDTA 튜브(4mL)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	368861
플러스 혈액 수집	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	362725
23G x 1 바늘	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	300800
LUER LOK 주사기 (3mL)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	309658
소구경 확장 튜브가 있는 버터플라이 바늘	요르겐 크루즈 A/S	121714
1% 버콘	노메코 A/S	849265
MagNA Pure LC DNA 분리 키트 I - 용해/결합 버퍼 - 리필	로슈진단 A/S	3246752001
MagNA Pure LC 총 핵산 분리 키트	로슈진단 A/S	3038505001
Nunc™ 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(1,8mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(3,6mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ 바이오뱅킹 및 세포 배양 극저온 튜브(4,5mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag-5™ 자석	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12303디
전사 피펫(3.5 mL)	사르슈테트	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ 파인 팁 전사 피펫(1.5 mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	339652

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