$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 리포좀의 준비
- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl(Biotin-PE)의 클로로포름 현탁 원액의 양을 계산하여 원하는 최종 농도에서 희석된 원액을 만듭니다. 각각 10ml에서 400μM DOPC 및 80μM 비오틴-PE 인지질의 최종 농도를 만들려면 먼저 629μl의 10mg/ml DOPC 및 88μl의 10mg/ml 비오틴-PE를 별도의 유리 크로마토그래피 튜브에 넣습니다.
참고: 유리 해밀턴 주사기와 유리 크로마토그래피 튜브를 세척 용액(1L 95% 에탄올에서 60g 수산화칼륨, KOH를 함유한 120ml 물)으로 세척하는 동시에 DOPC 및 비오틴-PE의 클로로포름 현탁 원액을 옮기는 것이 중요합니다.
- 화학 물질 후드에서 아르곤 흐름으로 클로로포름을 말리십시오. 파라필름으로 크로마토그래피 튜브를 밀봉합니다.
- 새로 건조된 리포좀을 동결 건조기에서 하룻밤(O/N) 고진공으로 처리하여 잔류 클로로포름을 제거합니다. 당일 완료의 경우 60-90분 동안 건조하십시오.
- 동결 건조기가 작동하는 동안 약간의 희석 완충액을 준비합니다. 이 프로토콜의 경우, 25mM Tris, pH 8.0으로 구성된 25ml를 준비합니다. 150mM 염화나트륨; 및 2%(중량 기준) n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(OG) 세제. 처음 두 성분을 먼저 함께 섞은 다음 건조 OG 분말을 추가하기 전에 산소를 아르곤으로 대체합니다. 준비 후 OG 용액을 0.2 미크론 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인으로 여과하고 4°C에서 보관합니다.
- 또한, 1L의 Tris-saline buffer가 들어 있는 두 개의 screw-top bottle을 동일한 농도로 준비하되 OG는 포함하지 않습니다. 각각의 바닥에 증류수로 세척된 마그네틱 교반 막대를 놓습니다. Tris-saline 완충액 6리터를 추가로 준비합니다. 아르곤이 든 모든 병에서 산소를 제거하고 4°C에 놓습니다.
- 동결건조 후 건조된 지질을 Tris-saline OG 완충액에 용해시켜 각각 4mM 용액을 만듭니다. 예시 용량에 따라 DOPC 튜브에 2ml를 추가하고 Biotin-PE 튜브에 0.2ml를 추가합니다.
- 비오틴-PE 지질과 DOPC 지질을 함께 혼합합니다. 이는 결합된 비오틴이 인산염 헤드 그룹의 유동성을 손상시킬 수 있기 때문에 SLB의 이동성을 향상시킵니다. 80μM 비오틴-PE의 최종 농도를 만들려면 0.2ml의 4mM 비오틴-PE와 1ml의 4mM DOPC를 혼합합니다. 그런 다음 Tris-saline OG 버퍼 8.8ml를 추가합니다.
- 400μM DOPC의 최종 농도를 얻으려면 1ml의 4mM DOPC와 9ml의 Tris-saline OG를 혼합하기만 하면 됩니다.
- 초음파 발생기에 얼음물을 채웁니다. 유틸리티 클램프를 사용하여 희석된 인지질이 들어있는 유리관을 초음파 처리기 중앙에 놓습니다. 용액이 투명해질 때까지 희석된 인지질을 10분 동안 초음파 처리합니다.
메모: 초음파 처리로 열이 발생하므로 온도를 낮게 유지하기 위해 초음파 발생기 수조에 얼음을 넣으십시오.
- 튜브를 아르곤으로 채워 공기 중의 산소를 액체로 대체하고 파라 필름으로 밀봉하십시오.
2. 리포좀 투석
- 롤에서 적절한 길이(이 예에서는 40cm)의 건조 투석 튜브(분자량 절단: 12-14,000, 직경: 6.4mm)의 두 섹션을 각 인지질 희석액에 대해 하나씩 자릅니다.
- 유리 비커에 증류수 200ml를 2분 동안 담가두면 튜브 섹션이 재수화됩니다.
- 높은 설정에서 5분 동안 또는 적어도 물이 끓을 때까지 전자레인지에 돌립니다.
- 각 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶고 몇 밀리리터의 Tris-saline-OG 버퍼로 내부를 헹굽니다. 그런 다음 이 세척 버퍼를 가능한 한 많이 짜서 내부에 남아 있는 버퍼의 양을 최소화하십시오.
- 층류 후드에서 희석된 인지질을 각 튜브에 추가하고 모든 공기를 배제하기 위해 열린 끝을 작은 투석 튜브 마개로 고정합니다. 완전한 공기 배제는 "급수선" 아래에 클램핑하여 소량의 샘플을 희생해야 합니다.
- OG 없이 이전에 준비된 Tris-saline buffer 병에 샘플을 담그십시오. 다시 밀봉하기 전에 아르곤으로 병의 산소를 옮기고 4°C에서 O/N을 교반합니다.
- 튜브를 OG가 없는 Tris-saline buffer의 새 병에 12시간마다 최소 3회 옮깁니다.
- 투석된 지질을 제거하기 직전에 산소를 대체하기 위해 각각 아르곤으로 채워 지질을 분취시킬 수 있는 여러 개의 작은 튜브를 준비합니다.
- 36시간 후, 투석 병을 층류 후드에 넣고 병에서 투석 튜브를 제거합니다. 젖은 유출수를 모을 수 있는 벤치 기저귀나 비커를 준비하십시오.
- 클립 위의 투석 튜브를 자른 다음 클립을 제거하고 피펫을 통해 투석된 지질 용액을 얼음 위에 아르곤 가스로 채워진 미리 준비된 튜브의 1ml 부분 표본으로 조심스럽게 옮깁니다.
- 수성 리포좀 용액을 분취하고 아르곤 스트림을 사용하여 각 튜브에서 산소를 다시 대체합니다.
- 리포좀을 4°C에서 보관하십시오. 얼리지 마십시오.
3. 인간 NK 세포 분리 및 배양
- 15ml 말초 혈액 또는 버피 코트를 50ml 원뿔형 튜브에 분주합니다. 이 혈액을 1% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)를 1:1 비율로 희석합니다.
- 13ml의 혈청학 피펫으로 튜브 바닥에 Ficoll 10ml를 부드럽게 추가합니다.
- 이 튜브를 가속기와 차단기를 사용하여 1,200 x g에서 20분 동안 원심분리하거나 가장 낮은 설정에서 원심분리합니다.
- 원심분리 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 떠다니는 흐린 흰색 중간층을 수집하며, 이 중간층은 투명한 노란색 상층과 더 흐린 창백한 색의 하층 사이의 교차점을 수집하며, 둘 다 적혈구(RBC)의 가장 낮은 층 위에 있습니다. 참고 PBMC를 수집할 때 적혈구를 수집하지 마십시오.
- 수집된 PBMC를 새 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 1% FBS가 포함된 PBS로 용량까지 희석합니다. 이번에는 브레이크와 액셀러레이터를 최대로 켠 상태에서 300 x g에서 5분 동안 다시 원심분리기를 사용합니다.
- 상등액을 버리고 1% FBS를 함유한 PBS 10ml에 세포를 재현탁합니다.
- 3.6단계와 동일한 설정에서 한 번 더 원심분리하는 동안 세포를 계산합니다.
- 상층액을 한 번 더 버리고 R10 배지에 세포를 1,000만 cells/ml의 밀도로 재현탁합니다.
- 5ml 폴리스티렌 튜브에 3,000만 개의 세포를 넣고 제조업체의 지침에 따라 자기 분리 키트를 사용하여 NK 세포를 분리합니다. 분리 후, 세포를 하나 더 계수하고 IL-2(100 U/ml)가 보충된 R10 완전 배지(88% Roswell Park Memorial Institute 배지, RPMI, 10% FBS, 1% N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산, HEPES, 1% 피루브산 나트륨)에서 500,000 cells/ml의 밀도로 재현탁합니다. CO2 인큐베이터에서 37°에서 배양하고 배지를 매주 2-3회 교체하십시오.
4. Glass 지지 Planar Lipid Bilayer 조립
- 비커에서 30% 과산화수소와 황산을 1:3의 비율로 혼합하여 100ml 피라냐 용액을 준비합니다.
메모: 항상 적절하게 지정된 화학 흄 후드에서 황산과 같은 유해 물질로 작업을 수행하십시오.
- 이 용액에 2개의 직사각형 #1.5 커버슬립을 피라냐 용액에 20-30분 동안 담그십시오.
메모: 피라냐 용액으로 커버슬립을 청소하는 것이 필수적입니다.
- 커버슬립을 세척하는 동안 이전에 준비된 400μM DOPC 지질 튜브 1개와 이전에 준비된 80μM 비오틴-PE 지질 튜브 1개를 취합니다. 얼음에 실어 아르곤 탱크로 운반하십시오.
- 아르곤이 있는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에서 산소를 치환한 다음 DOPC와 Biotin-PE를 1:1 비율로 함께 추가합니다. 구체적인 부피는 실험 요구 사항에 따라 다르지만 각각 최소 2μl여야 합니다. 아르곤 가스와 함께 혼합 튜브의 산소를 한 번 더 치환하고 개별 시약 튜브도 제거한 후 후자를 냉장고에 다시 넣습니다.
- 청소가 끝나면 증류수로 커버 슬립을 철저히 헹굽니다. 커버슬립을 꺼내 몇 분 동안 자연 건조시킵니다.
- 단계 5.4에서 제조된 리포좀 혼합물 1.5μl를 회수하고 챔버 슬라이드의 레인 챔버 중 하나에 한 방울 떨어뜨려 분취합니다. 레인당 2방울을 사용하는 것이 일반적이지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
- 드라이 커버슬립을 물방울 위에 빠르고 효율적으로 놓습니다. 커버슬립을 놓았을 때 방울이 합쳐지지 않도록 방울의 간격이 충분한지 확인하십시오. 또한, 방울이 챔버 벽의 가장자리에 닿지 않고 원형으로 잘 정의되어 있는지 확인하십시오. 커버슬립과 슬라이드 사이의 방수 밀봉을 보장하기 위해 각 레인 사이와 주변을 단단히 누릅니다.
- 마커 펜을 사용하여 방울의 위치를 표시합니다.
- 챔버를 통해 100μl의 수성 5% 카제인을 통과시켜 이중층을 차단합니다. 흐름 챔버에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 100μl의 스트렙타비딘을 333ng/ml의 농도로 각 레인에 주입합니다. 실온(RT)에서 10-15분 동안 배양합니다. 그 후, 각 레인에 3ml의 HEPES-Buffered Saline(HBS)/1% 인간 혈청 알부민(HSA)을 통과시켜 과도한 streptavidin을 제거하여 세척합니다.
- Alexa Fluor 568과 같은 비오틴화 형광 표지 항-CD16 100μl를 이전에 가장 효과적인 것으로 확인된 단백질 농도로 첨가합니다. 어둠 속에서 20-30 분 동안 배양하십시오. 각 레인에 3ml의 HBS/1% HSA를 통과시켜 다시 세척합니다.
- 100μl의 D-비오틴을 25nM 농도로 챔버를 통해 흐르게 하여 과도한 스트렙타비딘과 결합하여 스트렙타비딘이 세포에 비특이적으로 결합할 가능성을 제거합니다.
- NK 세포를 계수하고 HBS/1% HSA에서 500,000/ml의 농도로 재현탁합니다.
- 세포를 회전시키는 동안 레인당 HBS/1% HSA 3ml를 추가로 사용하여 챔버에서 D-비오틴을 세척합니다.
- NK cell을 추가하기 전에 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 또는 컨포칼 현미경에서 광표백 후 형광 회수(광표백 후 형광 회수, FRAP)를 통해 SLB에서 리간드의 이동도를 확인합니다.
- 세포가 회전을 마치고 원하는 농도로 재현탁되면 각 레인에 100μl를 추가합니다.
- 챔버를 37° 5% CO2 인큐베이터에 30-60분 동안 놓습니다.
- 이 잠복기가 끝나면 RT에서 10-20분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고 파라포름알데히드를 제거하기 위해 각 레인을 통해 3ml의 PBS를 실행하여 세척합니다.
- 400μl의 블로킹 버퍼(PBS의 일반 당나귀 혈청 5% 및 Triton X-100 0.2%)를 추가합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 200 μl의 희석된 형광 표지된 팔로이딘(1 unit/ml 표지된 팔로이딘)과 형광 표지된 항 퍼포린 단클론 항체(500 ng/ml 항 퍼포린 mAb)를 첨가하여 F-actin 및 퍼포린을 염색합니다. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS 3ml를 실행하여 씻으십시오. 챔버는 이미징 준비가 되었습니다.
5. STED를 사용한 Lipid Bilayer에서 NK Synapse의 이미징
- 필요한 모든 하드웨어 모듈을 켭니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 시작합니다. 공진 스캐닝과 STED 모듈을 모두 활성화합니다. 이러한 선택을 한 후 소프트웨어가 시작될 때까지 약 3-5분 동안 기다립니다.
- 화면 상단의 "구성" 탭을 클릭합니다.
- "Laser Config"를 선택한 다음 백색광과 STED 592nm 레이저를 켭니다.
- 100x 대물렌즈를 선택하고 여기 레이저 빔을 592nm 공핍 레이저에 정렬합니다.
- "Laser Config" 모듈을 선택하고 592 공핍 레이저를 끈 다음 660nm 공핍 레이저를 켭니다.
- 슬라이드를 무대 위에, 렌즈 위에 놓습니다. 경계가 설정된 이중층 영역에 결합된 세포를 백색광 램프와 접안렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다.
- "Acquisition" 탭으로 돌아가서 "Configuration" 탭의 바로 오른쪽에 있습니다.
- "Switch to Whitelight" 탭을 클릭한 다음 해당 모듈을 켜고 여기 레이저 라인을 적절한 파장으로 드래그합니다.
- 사용 가능한 목록에서 원하는 검출기를 선택한 다음 적절한 파장 범위를 포함하도록 검출 범위를 설정합니다.
메모: 감지 범위를 여기 빔 바로 아래에 두지 마십시오.
- 왼쪽의 "Acquire" 도구 모음에서 "Seqential" 버튼을 클릭하여 왼쪽 도구 모음 하단에 있는 Sequential Scanning 대화 상자를 불러옵니다. 이를 통해 사용자는 각각 다른 색상에 대해 다른 여기 빔을 가진 여러 시퀀스를 추가할 수 있습니다. "Between Frames"를 클릭한 다음 5.9 및 5.10단계와 같이 각 추가 색상에 대한 여기 주파수, 감지기 및 감지 범위를 설정합니다.
- 모든 설정이 최적화되면 "시작"을 눌러 수집 프로세스를 시작합니다.