유세포 분석을 위한 Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay 시료 전처리

초록

출처: McBride, J. E., et al. 인간 전혈에서 자연 살해 세포 용해 활성의 유동 세포 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 형광으로 염색된 표적 세포에 대한 자연 살해 세포의 용해 활성을 보여줍니다. 이 방법은 죽은 세포를 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 표적 세포를 정량화함으로써 NK 세포 유도 세포 독성을 측정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 컨트롤 준비

1. 다음을 적절하게 라벨이 표시된 별도의 1.5ml 튜브에 옮깁니다.
   1. 재현탁된 DiO 표지 K562 세포를 포함하는 새로운 IMDM 500μL를 "이중 양성" 표지된 1.5mL 튜브에 추가합니다.
   2. 재현탁된 DiO 표지 K562 세포를 포함하는 새로운 IMDM 500μL를 "DiO 전용" 표지된 1.5mL 튜브에 추가합니다.
   3. 재현탁된 라벨링되지 않은 K562 세포를 포함하는 새로운 IMDM 500μL를 "Propidium Iodide (PI) only" 표지된 1.5mL 튜브에 추가합니다.
2. 더블 포지티브 및 PI 전용 튜브를 55°C 수조에 5분 동안 놓습니다.
3. 5분이 경과한 후 튜브를 제거하고 70% 에탄올로 닦아냅니다.
4. 더블 포지티브에 10L의 PI를 추가하고 PI만 1.5mL 튜브에 추가합니다.
5. 3개의 K562 표적 세포 대조군을 모두 37°C의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
6. 30분의 배양 시간이 경과한 후 163 x g에서 2분 동안 3개의 K562 표적 세포 대조군을 모두 원심분리합니다.
7. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
8. 각 대조군을 20μL의 새로운 IMDM 세포 배양 배지로 재현탁하고 최적의 DiO 신호를 위해 최소 30분 동안 5% CO₂가 포함된 37°C 인큐베이터에 그대로 둡니다.
   메모: 이제 이미징 유세포 분석기를 통해 컨트롤을 실행할 준비가 되었습니다.

2. 세포 독성 분석 샘플 준비

1. 그에 따라 각 샘플/참가자에 대해 1.5mL 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다.
2. 피펫은 각 튜브에서 NK 세포와 DiO 표지된 K562 세포의 비율을 원했습니다.
   참고: 예를 들어, K562 타겟 셀과 NK effector 셀의 원하는 비율은 1:5입니다.
3. 135 x g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.
4. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
5. 인터루킨-2(IL-2) 및 2-메르캅토에탄올(2-ME)(불완전한 NK 세포 배양 배지) 없이 500μL의 NK 세포 배지에 NK-DiO 표지 K562 세포 혼합물을 재현탁합니다.
   참고: 불완전한 NK 세포 배양 배지는 L-글루타민, 리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드가 없는 중탄산나트륨이 포함된 Minimum Essential Medium Eagle입니다.
6. 각 튜브에 5μL의 PI를 추가합니다.
7. 163 x g에서 2분간 원심분리기
.
8. 37°C에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
9. 2시간 배양 후 163 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
10. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
11. 25μL 불완전 NK 세포 배양 배지에서 세포를 재현탁합니다.

3. 자발적("S") 샘플 준비

1. 500 μl의 DiO 표지 K562 세포(1 x 106 cells/mL 농도)를 1.5 mL 튜브에 피펫팅합니다.
2. 각 튜브에 10μL의 PI를 추가합니다.
3. 원심분리기 튜브를 163 x g에서 2분
간 사용합니다.
4. 37°C에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
5. 2시간 배양 후 163 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
6. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
7. 25μl 불완전 알파-최소 필수 배지(α-MEM) 세포 배양 배지에서 세포를 재현탁합니다.

4. 이미징 유세포분석기를 사용한 데이터 수집

1. 이미징 유세포 분석기의 전면 도어 내부에 있는 녹색 버튼을 눌러 기기를 켭니다.
2. 이미징 유세포 분석기와 연결된 모든 컴퓨터를 켭니다.
3. 이미징 유세포 분석기 소프트웨어를 실행합니다.
4. "시작" 버튼을 클릭하여 시스템을 플러시하고 샘플 라인을 준비합니다.
5. "시작"이 완료되면 "보정" 창을 닫습니다.
6. 채널 할당: 왼쪽 상단에서 각 채널을 클릭하여 할당합니다.
7. 오른쪽에서 산점도 버튼을 클릭하여 Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05, FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01의 4개의 산점도를 생성합니다.
8. 먼저 "Double Positive" 컨트롤을 사용하여 샘플 분석을 시작합니다.
   1. "로드"를 클릭하십시오.
   2. 1.5ml 튜브에 "더블 포지티브" 샘플이 들어 있습니다.amp1.4-1.8단계에서 s에 samp르 로더.
   3. "배율" 탭에서 40X 목표를 선택합니다.
   4. 405mW 및 642mW 레이저를 켭니다.
   5. "명시야" 채널을 켭니다.
   6. "강도 선택"을 클릭하십시오.
   7. "Double Positive" 대조군을 기반으로 sample, 검출기가 과부하되지 않도록 405mW 레이저에 대해 원하는 강도를 결정합니다.
      메모: 예를 들어, 이 실험의 최적 강도는 11mW로 설정되었습니다.
9. 원하는 설정이 완료되면 데이터를 수집합니다.
   1. "File Acquisition" 탭에서 사용자 지정 파일 이름 텍스트를 입력합니다. 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다.
   2. "Collect" 옆에 획득할 셀 수를 입력합니다. 일반적으로 이 숫자는 1,000에서 10,000 사이입니다.
   3. "Acquire"를 클릭합니다.
      참고: 원하는 수의 셀을 획득하면 데이터 파일이 이전에 선택한 폴더에 자동으로 저장됩니다.
10. 수집이 완료되면 다음 제어 샘플을 로드합니다(DiO 전용 제어).
    1. "로드"를 클릭하십시오.
    2. 1.5mL 튜브에 "DiO only" s를 놓습니다.amp르 로더.
    3. "배율" 탭 아래의 40X 대물렌즈를 선택된 상태로 둡니다.
    4. 405mW 레이저를 켠 상태로 둡니다.
    5. 642mW 레이저와 "명시야" 채널을 끕니다.
       참고: 이제 원하는 설정이 완료되었으므로 데이터를 수집할 수 있습니다.
    6. "File Acquisition" 탭에서 사용자 지정 파일 이름 텍스트를 입력하고 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. "Collect" 옆에 획득할 셀 수를 입력합니다. 일반적으로 이 숫자는 1,000입니다.
    7. "Acquire"를 클릭합니다.
       메모: 원하는 수의 셀을 얻으면 데이터 파일이 이전에 선택한 폴더에 자동으로 저장됩니다.
11. "PI 전용" 제어 샘플에 대해 4.10단계를 반복합니다. 이제 실험 샘플을 수집할 준비가 되었습니다.
12. "자발적 'S' 샘플"을 포함한 나머지 실험 샘플을 다음과 같이 처리합니다.
    1. "배율" 탭 아래의 40X 대물렌즈를 선택된 상태로 둡니다.
    2. 405mW 및 642mW 레이저를 켭니다.
    3. "명시야" 채널을 켭니다.
    4. "강도 설정"을 클릭하십시오.
    5. "File Acquisition" 탭에서 사용자 지정 파일 이름 텍스트를 입력하고 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 사용자 지정 파일 이름 텍스트를 입력합니다.
    6. "Collect" 옆에 획득할 셀 수를 입력합니다.
    7. "획득" 버튼을 클릭합니다.
       메모: 원하는 수의 셀을 얻으면 데이터 파일이 이전에 선택한 폴더에 자동으로 저장됩니다.
13. 모든 실험 샘플에 대해 4.12단계를 반복합니다.
14. 모든 실험 데이터와 파일을 수집한 후 "Shutdown" 버튼을 클릭하여 시스템을 멸균합니다.

5. 이미징 유세포 분석기 샘플 분석

1. 이미징 유세포분석기 분석 소프트웨어 애플리케이션을 엽니다.
2. "파일"에서 실험 단계를 엽니다. RIF 파일.
3. 단일 색상을 사용하여 새 매트릭스를 만듭니다. 이미징 유세포 분석기 소프트웨어의 보상 탭에서 "새 매트릭스 생성"을 선택하여 RIF 파일(DiO 전용 제어 및 PI 전용 제어, 4.10 및 4.11 단계에서 생성됨).
   참고: 소프트웨어는 단일 색상 파일을 선택하라는 메시지를 표시하고 이를 병합하여 채널 보정을 적용하기 위해 선택해야 하는 매트릭스 파일(.ctm 파일 확장자)을 생성합니다.
4. 소프트웨어의 "빌딩 블록" 기능을 사용하여 점도표를 만듭니다.
   1. 점도표(BrightFieldGradient_RMS vs frequency)를 만들어 초점이 맞춰진 세포를 게이트합니다. 게이트를 "Focus"라고 부릅니다(그림 1A).
   2. "Focus" 게이트를 사용하여 Bright Field Area 대 Bright Field Aspect Ratio의 점도표를 만들어 singlet cell을 게이트합니다. 게이트를 "Single"이라고 부릅니다(그림 1B).
   3. "Single" gate를 사용하여 Intensity_MC_Ch02 대 Intensity_MC_Ch5의 점도표를 만듭니다. 이 플롯을 사용하여 DiO 양성 세포(표적, 살아있음) 및 PI-DiO 이중 양성 세포(표적, 사망)를 식별하고 게이트합니다(그림 1C).
      메모: 5.4.1, 5.4.2 및 5.4.3 단계에서 설명한 모든 플롯은 소프트웨어의 "빌딩 블록" 기능을 사용하여 생성할 수 있습니다.
5. 점도표의 통계 기능을 클릭하면 각 게이트의 셀 번호에 액세스할 수 있습니다.
6. 다음 공식을 사용하여 자연 표본 및 실험 표본에서 불합격 표적의 백분율을 계산합니다.
   표본의 불멸 표적 % = (#dead 표적 x 100)/(#live 표적 + #dead 표적)
7. 다음 공식을 사용하여 세포 독성을 계산합니다.
   % 세포독성 = [(Experimental dead-Spontaneous dead)/(100-Spontaneous dead)]x100

결과

그림 1: 세포독성 활성 분석을 위한 대표적인 히스토그램, 산점도 및 이미지. (A) 초점 세포 분석. (B) 단일 세포 분석. (C) 표적 세포 염색 분석. 모든 결정은 각 이벤트에 첨부된 이미지를 사용하여 이루어집니다. 분석 소프트웨어에서 그래프에서 이벤트를 클릭하기만 하면 액세스할 수 있습니다. (D) apoptotic NK 세포와 살아있는 K562 표적을 보여주는 이중항 이벤트의 대표 이미지. Ch01, 명시야. Ch02, 디오. Ch05, PI입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
K-562 림프모세포	증권 시세	CCL-243
Iscove의 수정된 Dulbecco의 미디어	증권 시세	2005년 30월 30	고포도당, L-글루타민, HEPES 함유, 멸균 여과
알파 최소 필수 매체	증권 시세	CRL-2407 (영문	리보뉴클레오시드 및 디옥시리보뉴클레오시드가 없지만 2mM L-글루타민 및 1.5g/L 중탄산나트륨
Propridium 요오드 염색 용액	BD 파밍겐	51-66211E
Vybranto DiO 세포 라벨링 솔루션	비브란토	V-22886
ImageStream X Mark II 이미징 유세포분석기
보존혈액 CD56 MicroBeads, 인간	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-090-875
ImageStream X Mark II 이미징 유세포분석기	EMD 밀리포어
스피드비즈	주식회사 암니스	제400030
INSPIRE 소프트웨어	EMD 밀리포어	버전 Mark II, 2013년 9월
Ideas 응용 소프트웨어	EMD 밀리포어		버전 6.1, 2014 년 7 월

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