검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 인간 정밀 절단 폐 절편(PCLS)의 일반적인 준비 및 후속 화학 물질 노출
참고: 폐를 채우려면 두 사람이 필요합니다. A형 및 B형 간염에 대한 최신 예방 접종 기록이 권장됩니다. 환자는 폐 이식 전에 C형 간염 바이러스(HCV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대해 정기적으로 검사를 받습니다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 활동성 감염이 진단되거나 의심되는 경우, 폐를 거부해야 합니다. 그럼에도 불구하고 모든 신선한 인간 폐 조직과 그로부터 파생된 샘플은 감염 가능성이 있는 것으로 취급되어야 하며, 직원의 직업적 안전을 보장하기 위해 해당 보호 조치(입자 필터 마스크(FFP2), 보호 안경, 장갑)을 취해야 합니다. 절차는 60 - 90분 정도 소요됩니다.
- 인간 폐엽의 온전함을 확인합니다.
메모: 흉막의 파열은 조직의 균일한 충전을 방해합니다. 인간의 폐 재료는 절제된 날부터 나온 것이어야 합니다. 얼음에 아가로스를 채우기 전에 실온(RT)에서 약 2시간의 보관 기간이 허용됩니다. 이 프로토콜에서 사용하는 조직은 절제술을 받는 환자로부터 얻은 것입니다. 사망한 환자의 것이 아닙니다. 조직을 얼음에 보관한 경우 채우기 전에 RT로 미리 예열하십시오. 그렇지 않으면 아가로스가 즉시 중합되어 균일한 충전이 불가능합니다.
주의: 토착 인체 물질과 접촉하는 모든 사람은 실험복, 장갑 두 켤레, 모자, 안면 마스크 및 보안경으로 구성된 보호복을 착용하도록 합니다. 인체 물질은 잠재적으로 전염성이 있습니다.
- 저겔화 아가로스 7.5g의 무게를 달아 250mL의 중증류수에 첨가합니다. 아가로스가 녹을 때까지 전자레인지에 아가로스를 끓입니다. 아가로스의 녹는 점과 겔화점에 따라 약 40 °C로 냉각합니다.
메모: 로브 크기에 따라 여러 플라스크가 필요합니다.
- 예열 및 배양 매체(재료 표)를 37°C.
로 유지
메모: 아가로스가 너무 뜨거우면 배양 배지의 비타민이 효과를 잃고 세포가 손상됩니다. 배지/아가로스 용액의 온도가 37°C 미만이면 겔화 과정이 시작되어 폐의 균일한 충전이 손상됩니다. 37 °C에서 39 °C의 온도 범위만 권장됩니다.
- 시작하기 전에 필요한 모든 재료를 손이 닿는 곳에 두십시오: 클램프 5 - 10개, 약 1m 길이의 유연한 카테터, 카테터 연결부에 맞는 적절한 주사기(예: 50mL), 얼음으로 채워진 아이스 박스.
- 실리콘 튜브를 삽입하고 튜브와 평행한 방향으로 클램프로 고정하여 기관/주 기관지를 캐뉼레이트하여 클램프가 조직을 끼이지 않고 실리콘 튜브와 함께 함께 짜내도록 합니다.실리콘 튜브가 내부에 고정되어 있고 충전 절차 중에 빠져 나오지 않는지 확인합니다. 다른 모든 기관지, 혈관 및 부상을 clamps, 충전 절차 중에 아가로스가 누출되지 않도록 합니다.
- 등가량의 3% 저겔화 아가로스를 비커에서 배양 배지와 혼합합니다. 50mL 주사기를 사용하여 혼합물을 폐에 주입합니다. 주사기에 매체를 다시 채우기 전에 손가락이나 클램프로 카테터를 클램프로 닫아 기포와 아가로스 역류를 방지합니다. 폐엽이 완전히 팽창할 때까지 폐엽을 채웁니다. 옆쪽의 폐 흉막을 조심스럽게 만지십시오. 흉막은 평평하고 단단해야 합니다.
메모: 폐엽의 크기에 따라 최대 2 또는 3L의 아가로스/중간 용액이 필요할 수 있습니다.
- 단일 표본 내에 여러 기관지가 있는 경우 각 기관지에 대해 1.5-1.6단계를 반복합니다.
- 주입된 아가로스의 양에 따라 20-40분 동안 아가로스를 겔화하기 위해 폐를 얼음에 올려 놓습니다. 여러 면의 흉막을 조심스럽게 만져 단단하고 차가운지 확인하고 중합이 완료되었음을 나타내고, 그렇지 않으면 계속 기다립니다. 병리학자들은 폐를 조각으로 자르고, 샘플을 채취하고, 폐 물질을 얼음 위에 보관하여 운반할 것입니다.
- 날카로운 칼로 인간의 폐 조직을 3 - 5cm 조각으로 자릅니다.
메모: 날카로움을 보장하기 위해 모든 폐에 새 칼날을 사용하십시오.
- 티슈 슬라이서에 얼음처럼 차가운 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS) 400mL를 채웁니다. 즉시 선호하는 직경(예: 8mm, 10mm)의 코어링 도구가 있는 반자동 드라이버를 사용하여 폐 슬래브에서 원통형 조직 코어를 절단합니다.
메모: 이 직경은 기계 내부의 티슈 홀더의 직경과 동일해야 합니다.
- 폐 절편의 두께를 원하는 두께 값으로 조정합니다.
메모: PCLS 실험에는 일반적으로 약 250μm의 두께가 사용됩니다. 티슈 슬라이서 제조업체는 슬라이스 두께 검증을 위해 Tissue Slice Thickness Gauge를 권장합니다. 또는 컨포칼 현미경 검사와 결합된 전체 마운트 염색을 사용하여 Brismar et al.에 설명된 대로 슬라이스 두께를 결정할 수 있습니다.
- 조직 코어를 조직 슬라이서의 조직 홀더로 옮깁니다. 추(티슈 홀더의 일부)를 조직 코어 위에 놓습니다. 티슈 슬라이서에서 암 속도와 블레이드 속도를 6으로 설정합니다. 조직 코어를 PCLS로 절단하기 시작합니다.
- 시판되는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 500mL 보충: 페니실린(10,000 units/mL) 및 스트렙토마이신(10,000 μg/mL)과 영양 혼합물 F-12 DMEM/F12(1:1). 배양 배지를 멸균 상태로 며칠 동안 냉장고에 보관하십시오. 매체의 필요한 양만 예열합니다.
메모: 페니실린은 37°C에서 장기간 보관하면 비활성화됩니다. 혈청 조성이 배치마다 다르고 페놀-레드와 같은 염료가 분석을 방해할 수 있으므로 무혈청 및 무염료 배양 배지를 사용하십시오.
- 페트리 접시(100 x 15mm)에 25mL의 얼음처럼 차가운 배양 배지를 채웁니다. 매체는 유리 실린더의 클램프를 열어 조직 슬라이서에서 비커로 배출해야 합니다. 어플리케이터(예: 접종 루프)를 사용하여 비커의 슬라이스를 배양 배지가 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 페트리 접시를 인큐베이터(37°C, 5% CO2, 100% 습도)에 넣습니다. 세척 단계를 수행하기 전에 매체를 예열하십시오.
메모: 모든 추가 단계는 멸균 상태에서 수행됩니다.
- PCLS를 세척하기 위해 페트리 접시에 셀 스트레이너를 놓습니다. 세포 스트레이너를 통해 10mL 혈청학적 피펫으로 배양 배지를 완전히 제거하고 37°C의 예열된 신선한 배지 25mL를 추가합니다. 30분마다 이 단계를 3-4회 반복합니다.
메모: 셀 스트레이너는 슬라이스가 피펫으로 빨려 들어가는 것을 방지하여 슬라이스의 손상을 방지합니다.
- 웰당 2개의 슬라이스에 대해 최소 500μL의 배양 배지가 있는 24웰 배양 플레이트에 폐 슬라이스를 조심스럽게 옮깁니다. 폐 조직을 물질(3.1 - 3.4 단계 참조)에 노출시킵니다(예: 37°C에서 24시간 동안 5% CO2.
메모: 이식을 위해 가급적이면 접종 루프를 사용하고 조직 손상을 방지하기 위해 슬라이스가 루프에 떠오르도록 하는 것이 좋습니다. 충분한 신선한 배지가 부족하면 조직 조각의 세포 사멸을 유도할 수 있으므로 슬라이스를 더 이상 분리할 필요가 없습니다. 절편은 우물에서 서로 겹치거나 닿을 수 있으며, 이는 조직 생존력에 영향을 미치지 않습니다.
- 모든 잔여 인체 물질을 고정제(예: 10% 완충 포름알데히드)가 있는 플라스틱 플라스크에 최소 24시간 동안 넣고 폐기 과정에서 태우십시오.
주의: 포름알데히드는 독성이 있으므로 후드 아래에서 이 단계를 수행하십시오.
2. 물질에 대한 용액 준비
참고: 사용 직전에 작업 솔루션과 제어 장치를 준비하십시오.
주의: 안전 지침에 따라 물질을 취급하거나 알 수 없는 경우 잠재적으로 유해한 물질을 취급하고 일상적인 안전 예방 조치를 따르십시오.
- 수용성 물질을 배양 배지에 직접 용해시킵니다. 불용성 또는 잘 녹지 않는 화학 물질의 경우 먼저 물질 용해도에 따라 적절한 용매에 물질을 용해하십시오. 수용도(<0.1mg/mL)가 제한된 물질은 예를 들어 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 에탄올에 용해될 수 있습니다. 무독성 용매 농도는 사전에 적정에 의해 결정되어야 합니다. 매체에 희석될 때 용액에서 물질이 침전되지 않도록 하십시오.
참고: 암모늄 헥사클로로플라티네이트(HClPt) 및 소듐 라우레스 설페이트(SLS) 용액이 준비됩니다.
- 배양 배지 또는 용매에서 원하는 최고 농도의 100배에서 물질 저장 용액을 준비합니다. 12.5 mg HClPt 및 34.4 mg SLS의 무게를 측정하고 1 mL 배양 배지에 화학 물질을 용해시켜 원액을 준비합니다.
메모: 이러한 화학 물질에는 용제가 필요하지 않습니다.
- 예열된 매체에서 1:100의 최종 희석액을 준비합니다. 이전에 용매를 사용한 경우, 이 접근법은 모든 물질 농도에 대해 동일한 최종 용매 농도를 생성합니다.
- PCLS의 참조 처리를 위해 최종 용매 농도(예: 3.3단계에서 설명한 대로 1%)를 사용합니다. 결과 섹션에 언급된 화학 물질에 대해서는 용매 제어가 필요하지 않았습니다.
3. 세포독성 분석에 대한 긍정적 및 부정적 참고 문헌
- 모든 생존도 분석에 대해 다음과 같은 positive 및 negative control을 준비하십시오.
- 조직 제어: 세포 배양 조건(37°C, 5% CO2, 100% 습도)에서 24시간 동안 처리되지 않은 PCLS에 대한 참조로만 배양 배지에서 PCLS를 배양합니다.
- 차량 제어(필요한 경우): 세포 배양 조건(37°C, 5% CO2, 100% 습도)에서 24시간 동안 비히클로만 처리된 PCLS(3.4단계 참조)에 대한 기준으로 최종 용매 농도로 PCLS를 배양합니다.
- 포지티브 대조군: 4°C에서 1시간 동안 버퍼 용액에 1% 세제가 포함된 PCLS를 배양합니다.
메모: PCLS가 무색이 되면 조직이 죽은 것입니다. 총 L-젖산 탈수소효소(LDH)는 상층액에서 측정되며 흡수량은 약 1.9 - 2.3입니다. 조직은 WST-1 분석에 사용되며 흡수율은 약 0입니다.
4. 수용성 테트라졸륨 염 (WST-1) 분석에 의한 인간 PCLS의 화학적 유도 세포 독성 측정
참고: WST-1 분석은 웰당 2개의 PCLS가 있는 24웰 플레이트에서 수행됩니다. 가급적이면 각 매개변수에 대해 중복을 사용하고 측정 후 이러한 중복의 결과를 풀링하는 것이 좋습니다.
- 시작하기 직전에 WST-1 시약을 배지에 희석하여 작업 용액을 준비합니다. 필요한 작업 용액의 양은 24웰 플레이트의 250μL/웰입니다. 따라서 25μL의 시약과 225μL의 배양 배지를 하나의 웰에 혼합합니다.
- 1.16단계에서 PCLS를 배양한 후 사이토카인 측정 또는 LDH 분석과 같은 기타 테스트를 위해 상등액을 폐기하거나 사용합니다. 나머지 조직은 다음 단계에 사용됩니다.
- 웰당 WST-1 시약의 작업 농도를 250μL로 피펫하고 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 중에 PCLS가 WST-1 시약으로 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
- 플레이트를 궤도 셰이커(200rpm)에 놓고 WST-30 시약이 완전히 혼합되도록 1초 동안 조심스럽게 흔듭니다. 바닥이 평평한 새 96웰 플레이트를 가져와서 24웰 플레이트의 각 웰의 상층액에서 100μL를 복제하여 피펫팅합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm(참조: 630nm)에서 각 웰의 흡수를 측정합니다. 450nm에서 630nm의 흡수를 뺍니다. 메모: 세포독성 평가를 위한 신뢰할 수 있는 데이터는 생존 가능한 조직에서만 얻을 수 있습니다. 따라서 발표된 이러한 허용 기준은 각 실험에서 충족되어야 합니다. 이러한 기준이 충족되지 않으면 실험을 반복해야 합니다.
- 처리되지 않은 매체 대조군의 흡수는 0.6 이상이어야 하며, 그렇지 않으면 실험을 반복해야 합니다. 데이터가 이 요구 사항을 충족하는 경우 조직 대조군의 흡수 값을 100%로 설정하고 조직 대조군과 관련하여 처리된 샘플의 WST-1 감소를 계산합니다.
