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1. 비장세포 배지 및 유세포 분석 완충액의 제조
- 70% 에탄올로 세척된 생물학적 후드 아래에서 모든 단계를 수행하십시오.
- 예열된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 1x 배지 70mL(시판 가능하며 여과된 500ml 용량 멸균 병으로 제공됨)를 제거하고 멸균 튜브에 넣습니다. 제거된 매체는 나중에 프로토콜에서 사용됩니다.
- 나머지 RPMI 1640 1x 430mL에 50ml 불활성화 소 태아 혈청(FBS), 5mL 페니실린/스트렙토마이신, 5mL N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산(HEPES), 5ml 비필수 아미노산, 5mL 피루브산 나트륨 및 0.05mL 여과(1M) 2-메르캅토에탄올을 추가합니다.
메모: 열 충격을 주는 세포를 피하기 위해 37ºC로 설정된 수조를 사용하여 비장 세포 배지를 예열합니다. 이것은 세포 자멸사 유도를 피하는 데 중요합니다.
- 유세포 분석 완충액을 준비하려면 98ml 인산염 완충 식염수(PBS)에 FBS 2mL를 추가하고 사용할 때까지(바람직하게는 3일 이내) 냉장 보관합니다.
2. Nur77GFP 마우스 비장에서 비장 세포 현탁액 생성
- 6-8주 된 암컷 Nur77GFP 마우스에서 비장을 무균 적으로 분리합니다.
- 이를 달성하려면 멸균 후드 아래에서 작업하십시오. 희생된 쥐의 털, 가위, 집게를 70% 에탄올에 담그십시오.
- 마우스를 오른쪽에 놓고 왼쪽 위 복부 사분면의 피부와 근육을 자릅니다. 절개 부위를 검사하여 비장의 위치를 눈에 띄게 찾은 다음 잘라냅니다. 다음 단계를 수행할 준비가 될 때까지 비장을 비장 세포 매체에 얼음 위에 두십시오.
- 10ml의 예열된 비장 세포 배지 2ml가 들어 있는 5cm세포 배양 페트리 접시에 비장을 놓습니다.
- 용액이 탁해질 때까지 멸균 주사기 플런저를 사용하여 비장을 으깨십시오. 비장 콜라겐 매트릭스는 절차가 끝날 때까지 남아 있어야 합니다.
- 비장세포 배지를 광범위하게 매싱한 후 세포 현탁액을 수집하고 50mL 튜브에 놓인 70μm 세포 여과기에 통과시켜 파편이나 응고를 걸러냅니다.
- 500 x g에서 5분 동안 원심분리기 상등액을 폐기한 후, 세포 펠릿을 2-3mL의 자체 생산 또는 상업용 적혈구 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다. 피펫팅 후(2-3회) 서스펜션을 20-30초 동안 그대로 두십시오.
- PBS 5mL 또는 선택한 적절한 완충액을 추가한 다음 500 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 상층액(용해된 적혈구가 포함되어 있으므로 빨간색이어야 함)을 제거하고 세포 펠릿을 비장 세포 배지 2ml에 다시 현탁시킵니다.
- 혈구계를 사용하여 트리판 블루로 염색된 세포의 수를 세어 살아 있는 세포와 죽은(괴사) 세포를 구별합니다.
3. 비장세포 세포 현탁액에서 T세포 분리
- 세포 현탁액을 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 무혈청 RPMI 배지(단계 1.3에서 50ml)에 세포를 재현탁하여 10 x 106 cells/mL의 세포 농도를 얻습니다.
- 세포를 5mL 폴리스티렌 튜브로 옮기고 정제 단계 종료 시 순도 평가/비교를 위해 100μL의 비장 세포 분취액을 따로 보관합니다.
- 50 μL/mL의 세포 현탁액에 일반 랫드 혈청을 추가한 후 T 세포 분리 항체 칵테일(50 μL/mL)을 투여합니다.
- 세포 현탁액을 혼합하고 10분 동안 그대로 두십시오. 이 단계를 통해 항체 칵테일이 원치 않는 모든 세포에 결합할 수 있습니다.
- 스트렙타비딘 래피드 스피어(마그네틱 비드)를 2.5분 동안 추가한 다음 무혈청 배지를 사용하여 부피를 2.5mL로 가져옵니다.
- 튜브를 세포 분리 자석에 3분 동안 놓습니다.
- 자석을 잡고 용액을 한 번에 부어 T 세포 현탁액을 새 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
메모: 분리된 현탁액에는 정제된 T 세포가 포함되어 있습니다. 원치 않는 모든 세포는 자기 스트렙타비딘 비드에 결합된 튜브 측면에 고정됩니다.
- 트리판 블루(trypan blue)와 혈구계(hemocyometer)를 사용하여 분리된 T 세포를 계산합니다.
메모: 이 단계에서 유세포 분석으로 T 세포 분리 전후의 CD3+ 이벤트 비율을 분석하여 분리된 T 세포의 순도를 검증(선택 사항)할 수 있습니다.
- 간단히 말해서, 500 x g에서 1ml의 비장 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상등액을 버리고 세포를 1 x 106 cells/mL 농도의 유세포 분석 완충액에 현탁시킵니다.
- 형광 표지된 항-마우스 CD3 항체를 1:100 농도로 첨가합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 한 번 세척한 후 원심분리한 후 유세포 분석 버퍼(400 μL)에 다시 현탁시켜 유세포 분석에 의한 분석을 수행합니다.
4. T 세포 활성화 및 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 유도
- 현탁액 상태의 T 세포를 2.5 x 105 cells/well의 농도로 바닥이 둥근 96웰 플레이트에 파종합니다.
- 2ng/mL에서 재조합 인터루킨(IL)-7 및 CD3/CD28 마그네틱 비드(25μL/10,6세포)를 추가합니다. T 세포의 일부를 비드로 처리하지 않고 유지하여 활성화되지 않은 T 세포를 나타내는 후속 측정을 위한 음성 대조군 역할을 합니다.
- 12시간 후, 각 웰의 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 비드 세포 복합체/응집체를 파괴하여 96웰 플레이트에서 T 세포를 수확합니다. 모든 웰의 현탁액을 5mL 폴리스티렌 튜브에 모읍니다.
- 현탁액이 들어 있는 튜브를 이전에 T 세포 정제에 사용된 것과 동일한 세포 분리 자석 안에 넣고 5분 동안 그대로 둡니다.
- 자석을 잡고 한 번의 움직임으로 용액을 부어 T 세포 현탁액을 새 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
- 500 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 새로운 비장 세포 배지에 세포를 다시 현탁시켜 2 x 106 cells/mL의 농도를 얻습니다.
- 자극 후 12-24시간에 비활성화 T 세포와 비교하여 유세포 분석(품질 관리를 위한 선택 사항)을 통해 GFP 발현 강도를 평가합니다. 12
메모: GFP 형광은 Nur77GFP T 세포에 내재되어 있으며 T 세포 수용체인 TCR의 성공적인 활성화에 따라 나타납니다.
- 현미경 검사에 의한 생존력 및 활성화(선택 사항)를 평가하려면 분석 30분 전에 활성화된 세포를 0.2μg/ml의 농도로 Hoechst로 염색합니다. 바닥이 평평한 검은색 384웰 플레이트의 커버 슬라이드 또는 웰에 적절한 부피의 세포 현탁액을 추가하고 형광 현미경으로 검사하여 살아있는 세포를 평가합니다. 죽은 세포는 핵 염색을 유지하지 않습니다.
5. 저분자의 HTS(High Throughput Screening)
- 활성화된 T 세포(마그네틱 비드 또는 항체/CD40L) 또는 비활성화 그룹의 2 x 106 cells/mL에서 세포 현탁액을 준비합니다.
- 384웰 플레이트(부피 40μL)에 75,000개 세포/웰을 플레이트합니다. 바닥이 평평한 검은색 384웰 플레이트 또는 현미경 커버 슬라이드를 사용하여 Hoechst 염색을 사용하여 형광 현미경(HTS 이전의 선택적 품질 관리 단계)에 의한 생존 및 활성화 평가를 수행합니다(자세한 내용은 4.8단계 참조).
- 수동 또는 자동화된 시스템을 사용하여 선택한 약물(0.5% 디메틸 설폭사이드, DMSO에 용해됨)을 각 웰에 추가합니다.
- 차량(DMSO)을 양극(활성화) 및 음극(활성화되지 않은) 제어 웰에 추가합니다. DMSO 농도를 최대 0.5%까지 조정합니다.
- 37ºC 및 5% 이산화탄소, CO2에서 24시간(또는 선택한 배양 시간) 동안 플레이트를 배양합니다.
- 스크리닝 당일에 Hoechst 33342 염색 용액을 희석합니다(예: 384웰 플레이트의 세포에 10μL를 추가하여 총 부피 50μL를 생성). GFP 분석 30분 전에 Hoechst 용액을 첨가하여 0.2μg/mL의 농도를 달성하여 염색합니다.
- 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 각 웰에서 균일한 분포를 얻습니다.
메모: 이 단계는 세포가 흐름 방향과 반대편인 웰의 한쪽 면에 축적되는 경향이 있기 때문에 자동화 시스템을 사용하여 약물을 분배하는 경우(5.3단계) 중요합니다.
- 실온에서 45 x g에서 3분 동안 플레이트를 돌립니다.
- 접시를 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오.
- 자동 컨포칼 HCS(High Content Screening) 시스템을 사용하여 플레이트를 판독합니다.플레이트를 기계에 로드합니다. 대물렌즈를 40X 이상의 배율로 설정합니다. Hoechst(UV 램프)에는 카메라 #4를 사용하고 GFP(레이저 488)에는 카메라 #1을 사용합니다. 웰당 6-10개의 필드를 읽도록 기계를 설정합니다. 488nm(GFP 판독) 및 UV 광선(Hoechst 판독)에서 필드당 두 개의 순차 판독을 수행하도록 기계를 조정합니다. 대물렌즈를 40X 이상의 배율로 설정합니다.
메모: 이 시스템은 조정이 필요하지 않은 컴퓨터 현미경입니다. 초점 거리, 입사광의 강도 및 노출 시간은 모두 기계에 의해 자동으로 설정됩니다.