$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 기기 설정
참고: 부상 세포를 이미징하려면 z축에 자화된 두 개의 희토류 네오디뮴 자석을 동일한 극이 서로 마주 보도록 배치하여 자기장을 생성해야 합니다. 자석 사이의 거리는 자기장의 강도와 대상의 밀도에 따라 사용자 정의할 수 있습니다. 이 경우 자석은 50mm 길이의 1x1mm 정사각형 유리 모세관을 삽입하기에 충분한 1mm 공간으로 분리됩니다. 이 장치는 AutoCAD 디자인을 사용하여 3D 프린팅되었으며 요청 시 제공됩니다.
- 현미경을 완벽하게 수평으로 옆으로 눕힙니다.
메모: 표준 수직 위치에 배치된 현미경은 콘덴서와 대물렌즈에 대한 자석의 위치로 인해 공중에 떠 있는 물체를 이미징하는 데 직접 적합하지 않습니다. 이러한 제한은 쾰러 조명 요구 사항을 유지하면서 콘덴서가 빛을 모세관으로 집중시킬 수 있도록 하고 대물 렌즈가 자석 사이에서 공중에 떠 있는 세포를 이미지화할 수 있도록 현미경을 옆으로 눕히고 완벽하게 수평으로 놓음으로써 우회할 수 있습니다.
- 2개 또는 3개의 랩 잭을 사용하여 브레드보드 테이블의 스탠드를 지지하고 수평을 맞춥니다.
- 진동을 제한하려면 고무 d로 브레드보드 테이블을 지지하십시오.amp발을 담그다.
- 스테이지를 제거하고 부상 장치의 높이(y축)를 조정하기 위한 소형 실험실 잭과 두 개의 단일 축 평행 이동 스테이지로 교체합니다. 하나는 초점(Z축)을 조정하기 위한 것이고, 다른 하나는 모세관 스캔을 위한 것입니다.
- 두 개의 미니 시리즈 광학 포스트를 사용하여 자기 부상 장치를 실험실 잭에 연결합니다.
2. Carboxy-Microparticles/Beads에 대한 항체의 결합(PolyAn에 의해 프로토콜에서 수정됨)
참고: Rhesus, Rh(+) 검출을 위해서는 저밀도 비드(1.05g/mL)만 코팅해야 하지만, 세포 외 소포체 검출을 위해 고밀도 비드와 저밀도 비드 모두 코팅됩니다.
- 1mg에 해당하는 비드 현탁액을 꺼내고 0.5mL의 활성화 완충액(50mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산, MES(MW195.2, 1mL 내 9.72mg)) pH 5.0 및 0.001% 폴리소르베이트-20)를 추가합니다.
- 갓 만든 1.5M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC) 12μL(MW 191.7, 1mL 중 0.28755g)와 0.3M Sulfo-N-Hydroxysuccinimide(NHS) 12μL(MW 217.14, 1mL 중 0.0651g)를 얼음물에 추가합니다.
- 튜브를 오비탈 셰이커에 놓고 실온에서 1시간 동안 격렬하게 흔들어 비드의 카르복실기를 활성화합니다.
- 0.5mL의 커플링 버퍼(10x 인산염 완충 식염수, PBS 또는 0.1M 인산염 pH 7-9)를 추가하여 1시간 후 활성화를 중지합니다.
- 20,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하거나, 비드를 펠릿화할 수 없는 경우 0.45μm 원심분리 튜브 필터를 사용합니다. 상등액 또는 플로우 스루를 흡입합니다.
- 10x PBS 1mL로 비드를 2.5단계와 같이 3회 세척합니다.
- mg 비드당 25μg의 항체를 계산하고 원하는 항체를 활성화된 비드와 혼합하여 10X PBS에서 0.7-1.0 mg/mL의 최종 항체 농도를 얻습니다.
- 저속으로 설정된 튜브 로커에 튜브를 놓습니다. 커플링을 위해 실온에서 밤새 튜브를 부드럽게 굴립니다.
- 2.5단계를 반복하고 10x PBS 1mL로 비드를 두 번 세척합니다.
- 0.5mL의 1M 에탄올아민(98% 스톡 = 16.2M)을 완충액 pH 8.0과 0.02% 폴리소르베이트-20으로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 세척합니다.
- 2.5단계를 반복하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 1mL에서 비드를 한 번 세척합니다. 비드는 필요할 때까지 4°C에서 200μL의 DPBS에 보관할 수 있습니다.
메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. rh(+) 검출을 위한 혈액 채취 및 준비
- 원클릭 채혈 장치를 사용하여 Rrh(+) 기증자의 손가락을 찌르고 10μL의 혈액을 1mL의 DPBS에 수집합니다.
- Rh+ 세포를 형광 원형질막 염색으로 염색합니다. 선택적으로, Rh+ 세포의 1mL 현탁액에 1μL의 형광 염료를 추가합니다(1:1000 희석).
- 형광 염료로 세포를 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 5,600 x g에서 15초 동안 회전하여 세포를 펠렛화하고 1mL의 DPBS를 사용하여 3회 세척합니다. 칼슘 및 마그네슘(HBSS++)이 함유된 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 1mL에 재현탁합니다.
- 원클릭 채혈 장치를 사용하여 Rh(-) 기증자의 손가락을 찌르고 2μL의 혈액을 채취합니다.
메모: 2개 이상의 조건을 준비하는 경우 각 튜브에 1μL의 Rh(-) 혈액을 추가할 수 있을 만큼 충분한 혈액을 수집합니다.
- 필요한 실험용 튜브를 준비합니다: 비드 단독, 면역글로불린 G(IgG) 대조군, 샘플.
- 비드 단독: HBSS++ 174μL, IgG 대조군 비드 1μL, 고밀도 비드(1.2g/mL) 1μL 및 500mM Gd3+(60mM) 24μL를 추가합니다.
- IgG 대조군: 172 μL의 HBSS++, 1 μL의 IgG 대조군 비드, 1 μL의 고밀도 비드, 1 μL의 Rh- 혈액, 1 μL의 염색된 Rh+ 혈액 현탁액 및 24 μL의 500 mM Gd3+를 추가합니다.
- 샘플 튜브에 HBSS++ 172μL, RhD 방지 코팅 비드 1μL, 고밀도 비드 1μL, Rh- 혈액 1μL, 염색된 Rh(+) 혈액 현탁액 1μL 및 500mM Gd3+.
24μL를 추가합니다.
메모: 고밀도 비드는 참조를 위해 Rh 샘플에 추가됩니다.
4. 자기 부상 장치의 세포 분석
- 제조업체 지침에 따라 기기 시동을 수행합니다.
- 튜브가 채워질 때까지 50μL의 샘플을 모세관 튜브에 로드합니다. 모세관 밀봉제로 모세관 끝을 밀봉하여 기포가 없는지 확인합니다.
- 모세관 튜브를 상단 및 하단 자석 사이의 홀더에 로드합니다. 최적의 시청을 위해 스테이지와 초점을 조정하십시오.
메모: 세포/비드는 밀도와 Gd3+의 농도에 따라 자기 평형 위치에 도달하는 데 5-20분이 걸릴 수 있습니다. Gd3+의 농도가 높을수록 시간이 짧아집니다.