지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 이미지 분석을 위한 CD4⁺ T 세포 분리

1. 수집된 샘플에서 10개의⁷ 동결 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 림프절 단핵 세포(LNMC)가 포함된 1mL 분취액을 해동합니다. 멸균 후드에서 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 RPMI 9mL에 해동된 세포를 추가합니다.
   1. 4°C에서 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 10% FBS(완전 배지)를 함유한 5mL의 RPMI에 세포를 재현탁합니다. 37°C의 CO₂ 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.
2. 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 음성 면역자기 분류로 CD4⁺ T 세포를 정제합니다.
3. 갓 정제된 CD4⁺ T 세포의 수를 측정하려면 5μL의 세포 현탁액을 동일한 부피의 트리판 블루 용액과 혼합합니다. 혈구계에 cell-trypan blue 혼합물을 로드하고 혈구계의 5개 섹션 내부에 있는 살아있는 세포를 계수합니다.
4. 세포 수의 평균을 취하고 원래 세포 현탁액에 있는 세포 수를 계산합니다: 세포 수/1mL = 평균 수 x 2 x 10⁴. 격리된 셀의 총 수가 너무 작으면 셀을 계산하지 않고 그대로 사용합니다.
5. 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 10 5 cells/50 μL 이하에서 분석 완충액(20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na₂HPO₄, 5 mM D-glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ 및 1% human serum albumin)에 재현탁하고 준비가 될 때까지 세포를 4 °C(1-2시간 동안)로 유지합니다. 실험에 사용하십시오.
6. 모든 생물학적 폐기물은 관련 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
7. 대조 세포 집단으로 원하는 경우, 제대혈 PBMC에서 활성화된 CD8⁺ T 세포를 준비하고, 각각 10 μg/mL 및 1 μg/mL에서 항-CD3 및 항-CD28 항체 혼합물로 덮인 T25 배양 플라스크에 5mL의 완전한 배지에 10개의⁷ 세포를 배치합니다.
8. 다음날, 플라스크에서 활성화된 제대혈 세포를 제거하고 새로운 완전 배지로 1회 세척한 다음 2주 동안 재조합 IL-2(100U/mL)가 있는 상태에서 세포를 확장합니다.
9. 제대혈 CD8⁺ T 세포를 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 음성 면역자기 분류로 정제합니다. LN 및 PB CD8⁺ T 세포에 대해 1.3–1.6단계에서 설명한 대로 세포를 계수하고 배지를 분석 버퍼로 교환합니다.

2. 평면 지질 이중층 준비를 위한 구성 요소

1. (a) 0.4mM DOPC(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 리포좀, (b) 33 mol% DOGS-NTA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)숙시닐] (암모늄 염)) 지질을 함유하는 0.4 mM DOPC 리포좀, (c) 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotin) (sodium salt))를 함유하는 0.4 mM DOPC 리포좀).
2. 앞서 설명한 대로 5% 카제인 용액을 준비합니다.
   1. 카제인 분말 5g을 초순수 100mL에 녹이고 10M 수산화나트륨 350μL를 첨가합니다. 사용 가능한 스케일에 따라 느린 속도로 일반 자기 교반기로 모든 것을 저어주고 실온에서 2시간 동안 간 다음 4°C에서 밤새 저어줍니다. pH를 7.3으로 조정하고 4°C에서 100,000 x g에서 2시간 동안 용액을 초원심분리합니다. 0.22μm 멸균 필터로 상등액을 여과하고 -80°C의 분취량에 용액을 보관합니다.
      주의: 수산화나트륨 용액은 화학적 화상을 유발할 수 있으며 눈에 닿으면 영구적인 실명을 유발할 수 있습니다. 이 화학 물질 또는 그 용액을 취급할 때는 고무 장갑, 안전복 및 보안경을 사용하십시오.
3. 항-CD3 항체를 비오틴으로 라벨링하여 앞서 설명한 접근법으로 mono-biotinylated 항체 분자를 생성합니다.
   1. 0.1 mg/mL에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 비오틴-PEO4-NHS 용액을 준비합니다. 100mM 중탄산나트륨을 함유한 0.5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 포함된 항체 1mg에 3.7μL의 Biotin-PEO4-NHS 용액을 추가합니다.
   2. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양합니다. Alexa Fluor 488 NHS 에스테르 용액을 DMSO에서 10mg/mL로 준비합니다. Alexa Fluor 488 NHS 에스테르 용액을 Biotin-PEO4-NHS로 표지된 항체에 10배 몰 과잉으로 추가합니다.
   3. 일반 자석 교반기에서 천천히 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 혼합물을 배양합니다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결합되지 않은 염료를 분리합니다.
   4. 280nm(A280)에서 항체 용액의 광학 밀도를 측정하여 항체 농도를 결정합니다. 577nm(A577)에서 표지된 항체의 광학 밀도를 측정합니다.
   5. 다음 방정식을 사용하여 염료 대 항체 비율을 계산합니다.
      
      메모: 제조업체의 프로토콜에서 자세한 내용을 확인하십시오.
4. 앞서 설명한 바와 같이 초파리 발현 시스템에서 재조합 용해성 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1) 단백질을 발현합니다.
   1. cDNA 인코딩을 사용하여 ICAM-1의 ectodomain을 유도성 메탈로티오닌 프로모터를 사용하여 Drosophila 발현 벡터 pMT/V5-His로 복제하여 C-말단 말단에 His6 태그가 추가된 재조합 단백질을 생성합니다.
   2. S2 세포를 플라스미드 및 geneticin(G418) 발현 벡터를 함유하는 ICAM-1을 생성한 세포와 동시 transfection. 3주 동안 10% 태아 송아지 혈청(FCS)과 0.5mg/mL의 G418이 보충된 슈나이더의 초파리 배지를 사용하여 안정적인 트랜스펙턴트를 선택합니다. 무혈청 곤충 배지에서 세포를 확장하고 3d 동안 0.5mM CuSO₄로 단백질 발현을 유도합니다.
   3. 배양 상층액을 10배 농축하고 앞서 설명한 바와 같이 접선 유동 농축기를 통해 PBS에 대해 투석합니다.
   4. 공유 고정화된 항-ICAM-1 단클론 항체가 있는 Sepharose가 포함된 컬럼에 농축된 배양 상등액을 적용하고 결합된 ICAM-1을 50mM 글리신 완충액, pH 3.0으로 용리합니다. 용출된 ICAM-1 단백질을 2M Tris 완충액, pH 8.0으로 즉시 중화합니다.
   5. 용출된 물질을 PBS, pH 8.0에 대해 투석하고 투석된 물질을 Ni-NTA(니켈-니트릴로아세트산) 아가로스가 포함된 컬럼에 첨가합니다. 용리 용해성 ICAM-1, 200mM 이미다졸, pH 8.0. 용리된 물질을 PBS 완충액, pH 8.0에 대해 투석합니다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 정제된 ICAM-1에 Cyanine5 N-Hydroxysuccinimide(Cy5 NHS) 에스테르를 표시합니다.
      메모: 최상의 최종 염료 대 단백질 비율은 1:1입니다.
5. 파파인 분해를 통해 항-CD107a 항체로부터 Fab 단편을 생산하고 앞서 설명한 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피로 Fab 단편을 정제합니다. 제조업체의 지침에 따라 Fab 조각에 Alexa Fluor 568 NHS 에스테르를 표시합니다.

3. Glass-supported Planar Lipid Bilayers의 형성

1. 140mL의 진한 황산과 60mL의 30% 과산화수소를 혼합하여 새로운 산성 피라냐 용액을 준비합니다. 플로우 슬라이드용 유리 커버슬립을 산성 피라냐 용액에 30분 동안 담가 세척합니다. 폴리프로필렌 가위형 집게로 유리 커버슬립을 잡습니다.
   주의: 피라냐 용액은 매우 강한 산화제입니다. 용액을 취급하는 동안 항상 두꺼운 고무 장갑과 함께 보안경이나 고글 또는 전면 보호대를 착용하는 것을 잊지 마십시오. 흄 후드 아래에서만 피라냐 용액으로 작업하십시오. 폭발할 수 있으므로 사용 중 가열, 운반 또는 흔들지 마십시오. 피라냐 폐기물을 납이 함유된 구멍이 있는 유리병에 모읍니다. 적절한 폐기물 활용에 대해서는 기관 안전 위원회(Institutional Safety Committee)에 문의하십시오.
2. 세척된 커버슬립을 담수가 담긴 비커에 순차적으로 옮겨 초순수로 7x 헹굽니다. 젖은 커버 슬립을 따로 보관하여 남은 물이 깨끗한 유리에서 굴러 떨어지고 마른 유리는 남겨 둡니다.
   1. 또는 진공 펌프에 부착된 피펫 팁을 사용하여 커버슬립에 남아 있는 물방울을 조심스럽게 제거합니다.
3. 멸균 후드에서 다양한 지질을 희석하여 이중층을 만들기 위한 리포좀 혼합물을 생성합니다. 먼저 37μL의 DOPC 리포좀과 3μL의 Biotinyl-Cap-PE 리포좀을 결합합니다. 둘째, 14μL의 DOPC 리포좀과 15μL의 DOGS-NTA 리포좀을 혼합합니다. 셋째, 첫 번째 혼합물의 1μL를 두 번째 혼합물의 29μL에 첨가하여 최종 리포좀 혼합물을 제조합니다.
4. 멸균 후드에는 드라이 커버슬립이 있는 작업 공간을 가까이에 두십시오. 최종 리포좀 혼합물의 2 μL를 자체 접착 슬라이드 채널의 중앙에 정확하게 분취합니다(단계 3.3 참조). 깨끗하고 건조한 커버슬립을 슬라이드에 즉각적이고 매우 정확하게 정렬하고 슬라이드의 끈적한 면에 있는 커버슬립을 부드럽게 내립니다.
   1. 하나 이상의 슬라이드를 준비하는 경우 리포좀 혼합물이 빠르게 증발하므로 한 번에 하나의 슬라이드에서 작업하십시오. 슬라이드를 뒤집고 폴리프로필렌 가위형 집게의 외부 링을 사용하여 커버슬립과 슬라이드의 주변 접점에 부드러운 압력을 가하고 슬립이 슬라이드에 단단히 부착되어 누출을 방지하는지 확인합니다.
      메모: 커버슬립이 파손되거나 깨지지 않도록 슬라이드의 채널을 누르지 마십시오.
   2. 슬라이드를 다시 뒤집고 어셈블리의 외부 슬라이드 쪽에 있는 이중층 주위에 영구 마커가 있는 4개의 점을 그려 커버슬립과 채널 슬라이드 사이에 물방울처럼 보이는 형성된 이중층의 위치를 표시합니다.
5. 액체를 채널에 처음 주입하기 전에 채널의 한 포트를 입구 포트로 지정하고 다른 포트를 출구 포트로 지정하고 실험 내내 이 지정을 유지합니다.
6. 기포가 형성되는 것을 방지하려면 피펫 팁의 끝을 채널의 입구 포트에 직접 삽입하십시오. 슬라이드의 채널을 50μL의 따뜻한(최소 실온) 분석 버퍼로 천천히 채웁니다(버퍼 조성은 1.5단계 참조).
7. 0.5M 염화니켈(II) 용액을 준비합니다. 37°C의 수조에서 2mL의 카제인 용액을 30분 동안 해동하고 최종 농도 200μM의 염화니켈 용액을 보충합니다.
8. 먼저 채널의 입구 포트에 100μL의 카제인 용액을 주입한 다음 피펫팅으로 슬라이드의 출구 포트에서 100μL를 즉시 제거하여 이중층을 세척합니다. 각 채널의 입구 포트에 100μL의 카제인 용액을 주입하고 실온에서 45분 동안 슬라이드를 배양하여 동일한 용액으로 이중층을 차단합니다.
9. Cy5-ICAM-1-His₆ 및 스트렙타비딘 단백질의 분취량을 해동합니다. 분석 버퍼의 단백질을 각각 2μg/mL의 최종 농도로 결합합니다. 용액을 20,000 x g 및 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 응집체를 제거합니다.
10. 피펫팅으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 나머지 차단 용액을 제거합니다. ICAM-1 및 스트렙타비딘이 포함된 용액 100μL를 입구 포트에 주입합니다.
11. 실온에서 45분 동안 슬라이드를 배양합니다. 출구 포트에서 과도한 단백질 용액을 제거합니다. 먼저 채널의 입구 포트에 100μL의 분석 버퍼를 주입한 다음 출구 포트에서 100μL를 즉시 제거하여 이중층을 2x 세척합니다.
12. Alexa-Fluor-488 표지 항-CD3 항체를 분석 버퍼로 최종 농도 2μg/mL로 희석합니다. 100μL의 항체 용액을 슬라이드의 입구 포트에 주입하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 출구 포트에서 과도한 단백질 용액을 제거합니다. 3.11단계에서와 같이 100μL의 분석 버퍼로 이중층을 2x 세척합니다.

4. T 세포와 평면 이중층의 상호 작용 이미징

1. 예열tage와 컨포칼 또는 TIRF(전반사 형광) 현미경의 대물렌즈는 온도가 37°C에서 평형을 이룰 때까지 가열된 stage에 이중층으로 슬라이드를 설정합니다. 잉크 표시에 따라 스테이지를 적절한 위치로 이동하고 Cy 표지된 ICAM-1 분자의 형광을 사용하는 이중층에 초점을 맞춥니다.
   1. 컨포칼 현미경의 경우 61X 대물렌즈를 사용하고, TIRF 현미경의 경우 100X 대물렌즈를 적절한 필터 설정과 함께 사용합니다.
2. TIRF 현미경 검사에 의한 과립 방출 이미징의 경우, 세포를 엔트리 포트에 주입하기 전에 Alexa-Fluor-568 표지된 anti-CD107a 항체 Fab 단편을 최종 농도 4μg/mL로 세포 현탁액에 추가합니다.
   1. LN PB 또는 제대혈에서 분리한 준비된 CD4⁺ T 세포를 재현탁하고 이중층을 포함하는 슬라이드 채널의 진입 포트에 50μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
3. 원하는 필드 수를 선택하고 주입 후 30분 동안 2분마다 1회씩 각 필드의 이미지를 기록합니다.
4. 컨포칼 현미경의 명시야, 반사광 및 형광 채널(Alexa 488 및 Cy5)을 활용하여 이미지를 획득합니다. TIRF 현미경에서 Alexa-Fluor-488 및 Alexa-Fluor-568 형광에는 TIRF 모드를, Cy5 형광에는 광시야 모드를 사용하고, 명시야 이미징을 사용할 수 있습니다.