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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 이미지 분석을 위한 CD4+ T 세포 분리
- 수집된 샘플에서 10개의7 동결 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 림프절 단핵 세포(LNMC)가 포함된 1mL 분취액을 해동합니다. 멸균 후드에서 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 RPMI 9mL에 해동된 세포를 추가합니다.
- 4°C에서 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 10% FBS(완전 배지)를 함유한 5mL의 RPMI에 세포를 재현탁합니다. 37°C의 CO2 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.
- 다음 날, 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 음성 면역자기 분류로 CD4+ T 세포를 정제합니다.
- 갓 정제된 CD4+ T 세포의 수를 측정하려면 5μL의 세포 현탁액을 동일한 부피의 트리판 블루 용액과 혼합합니다. 혈구계에 cell-trypan blue 혼합물을 로드하고 혈구계의 5개 섹션 내부에 있는 살아있는 세포를 계수합니다.
- 세포 수의 평균을 취하고 원래 세포 현탁액에 있는 세포 수를 계산합니다: 세포 수/1mL = 평균 수 x 2 x 104. 격리된 셀의 총 수가 너무 작으면 셀을 계산하지 않고 그대로 사용합니다.
- 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 10 5 cells/50 μL 이하에서 분석 완충액(20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 및 1% human serum albumin)에 재현탁하고 준비가 될 때까지 세포를 4 °C(1-2시간 동안)로 유지합니다. 실험에 사용하십시오.
- 모든 생물학적 폐기물은 관련 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
- 대조 세포 집단으로 원하는 경우, 제대혈 PBMC에서 활성화된 CD8+ T 세포를 준비하고, 각각 10 μg/mL 및 1 μg/mL에서 항-CD3 및 항-CD28 항체 혼합물로 덮인 T25 배양 플라스크에 5mL의 완전한 배지에 10개의7 세포를 배치합니다.
- 다음날, 플라스크에서 활성화된 제대혈 세포를 제거하고 새로운 완전 배지로 1회 세척한 다음 2주 동안 재조합 IL-2(100U/mL)가 있는 상태에서 세포를 확장합니다.
- 제대혈 CD8+ T 세포를 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 음성 면역자기 분류로 정제합니다. LN 및 PB CD8+ T 세포에 대해 1.3–1.6단계에서 설명한 대로 세포를 계수하고 배지를 분석 버퍼로 교환합니다.
2. 평면 지질 이중층 준비를 위한 구성 요소
- (a) 0.4mM DOPC(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린) 리포좀, (b) 33 mol% DOGS-NTA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)숙시닐] (암모늄 염)) 지질을 함유하는 0.4 mM DOPC 리포좀, (c) 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotin) (sodium salt))를 함유하는 0.4 mM DOPC 리포좀).
- 앞서 설명한 대로 5% 카제인 용액을 준비합니다.
- 카제인 분말 5g을 초순수 100mL에 녹이고 10M 수산화나트륨 350μL를 첨가합니다. 사용 가능한 스케일에 따라 느린 속도로 일반 자기 교반기로 모든 것을 저어주고 실온에서 2시간 동안 간 다음 4°C에서 밤새 저어줍니다. pH를 7.3으로 조정하고 4°C에서 100,000 x g에서 2시간 동안 용액을 초원심분리합니다. 0.22μm 멸균 필터로 상등액을 여과하고 -80°C의 분취량에 용액을 보관합니다.
주의: 수산화나트륨 용액은 화학적 화상을 유발할 수 있으며 눈에 닿으면 영구적인 실명을 유발할 수 있습니다. 이 화학 물질 또는 그 용액을 취급할 때는 고무 장갑, 안전복 및 보안경을 사용하십시오.
- 항-CD3 항체를 비오틴으로 라벨링하여 앞서 설명한 접근법으로 mono-biotinylated 항체 분자를 생성합니다.
- 0.1 mg/mL에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 비오틴-PEO4-NHS 용액을 준비합니다. 100mM 중탄산나트륨을 함유한 0.5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 포함된 항체 1mg에 3.7μL의 Biotin-PEO4-NHS 용액을 추가합니다.
- 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양합니다. Alexa Fluor 488 NHS 에스테르 용액을 DMSO에서 10mg/mL로 준비합니다. Alexa Fluor 488 NHS 에스테르 용액을 Biotin-PEO4-NHS로 표지된 항체에 10배 몰 과잉으로 추가합니다.
- 일반 자석 교반기에서 천천히 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 혼합물을 배양합니다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 결합되지 않은 염료를 분리합니다.
- 280nm(A280)에서 항체 용액의 광학 밀도를 측정하여 항체 농도를 결정합니다. 577nm(A577)에서 표지된 항체의 광학 밀도를 측정합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 염료 대 항체 비율을 계산합니다.
메모: 제조업체의 프로토콜에서 자세한 내용을 확인하십시오.
- 앞서 설명한 바와 같이 초파리 발현 시스템에서 재조합 용해성 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1) 단백질을 발현합니다.
- cDNA 인코딩을 사용하여 ICAM-1의 ectodomain을 유도성 메탈로티오닌 프로모터를 사용하여 Drosophila 발현 벡터 pMT/V5-His로 복제하여 C-말단 말단에 His6 태그가 추가된 재조합 단백질을 생성합니다.
- S2 세포를 플라스미드 및 geneticin(G418) 발현 벡터를 함유하는 ICAM-1을 생성한 세포와 동시 transfection. 3주 동안 10% 태아 송아지 혈청(FCS)과 0.5mg/mL의 G418이 보충된 슈나이더의 초파리 배지를 사용하여 안정적인 트랜스펙턴트를 선택합니다. 무혈청 곤충 배지에서 세포를 확장하고 3d 동안 0.5mM CuSO4로 단백질 발현을 유도합니다.
- 배양 상층액을 10배 농축하고 앞서 설명한 바와 같이 접선 유동 농축기를 통해 PBS에 대해 투석합니다.
- 공유 고정화된 항-ICAM-1 단클론 항체가 있는 Sepharose가 포함된 컬럼에 농축된 배양 상등액을 적용하고 결합된 ICAM-1을 50mM 글리신 완충액, pH 3.0으로 용리합니다. 용출된 ICAM-1 단백질을 2M Tris 완충액, pH 8.0으로 즉시 중화합니다.
- 용출된 물질을 PBS, pH 8.0에 대해 투석하고 투석된 물질을 Ni-NTA(니켈-니트릴로아세트산) 아가로스가 포함된 컬럼에 첨가합니다. 용리 용해성 ICAM-1, 200mM 이미다졸, pH 8.0. 용리된 물질을 PBS 완충액, pH 8.0에 대해 투석합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 정제된 ICAM-1에 Cyanine5 N-Hydroxysuccinimide(Cy5 NHS) 에스테르를 표시합니다.
메모: 최상의 최종 염료 대 단백질 비율은 1:1입니다.
- 파파인 분해를 통해 항-CD107a 항체로부터 Fab 단편을 생산하고 앞서 설명한 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피로 Fab 단편을 정제합니다. 제조업체의 지침에 따라 Fab 조각에 Alexa Fluor 568 NHS 에스테르를 표시합니다.
3. Glass-supported Planar Lipid Bilayers의 형성
- 140mL의 진한 황산과 60mL의 30% 과산화수소를 혼합하여 새로운 산성 피라냐 용액을 준비합니다. 플로우 슬라이드용 유리 커버슬립을 산성 피라냐 용액에 30분 동안 담가 세척합니다. 폴리프로필렌 가위형 집게로 유리 커버슬립을 잡습니다.
주의: 피라냐 용액은 매우 강한 산화제입니다. 용액을 취급하는 동안 항상 두꺼운 고무 장갑과 함께 보안경이나 고글 또는 전면 보호대를 착용하는 것을 잊지 마십시오. 흄 후드 아래에서만 피라냐 용액으로 작업하십시오. 폭발할 수 있으므로 사용 중 가열, 운반 또는 흔들지 마십시오. 피라냐 폐기물을 납이 함유된 구멍이 있는 유리병에 모읍니다. 적절한 폐기물 활용에 대해서는 기관 안전 위원회(Institutional Safety Committee)에 문의하십시오.
- 세척된 커버슬립을 담수가 담긴 비커에 순차적으로 옮겨 초순수로 7x 헹굽니다. 젖은 커버 슬립을 따로 보관하여 남은 물이 깨끗한 유리에서 굴러 떨어지고 마른 유리는 남겨 둡니다.
- 또는 진공 펌프에 부착된 피펫 팁을 사용하여 커버슬립에 남아 있는 물방울을 조심스럽게 제거합니다.
- 멸균 후드에서 다양한 지질을 희석하여 이중층을 만들기 위한 리포좀 혼합물을 생성합니다. 먼저 37μL의 DOPC 리포좀과 3μL의 Biotinyl-Cap-PE 리포좀을 결합합니다. 둘째, 14μL의 DOPC 리포좀과 15μL의 DOGS-NTA 리포좀을 혼합합니다. 셋째, 첫 번째 혼합물의 1μL를 두 번째 혼합물의 29μL에 첨가하여 최종 리포좀 혼합물을 제조합니다.
- 멸균 후드에는 드라이 커버슬립이 있는 작업 공간을 가까이에 두십시오. 최종 리포좀 혼합물의 2 μL를 자체 접착 슬라이드 채널의 중앙에 정확하게 분취합니다(단계 3.3 참조). 깨끗하고 건조한 커버슬립을 슬라이드에 즉각적이고 매우 정확하게 정렬하고 슬라이드의 끈적한 면에 있는 커버슬립을 부드럽게 내립니다.
- 하나 이상의 슬라이드를 준비하는 경우 리포좀 혼합물이 빠르게 증발하므로 한 번에 하나의 슬라이드에서 작업하십시오. 슬라이드를 뒤집고 폴리프로필렌 가위형 집게의 외부 링을 사용하여 커버슬립과 슬라이드의 주변 접점에 부드러운 압력을 가하고 슬립이 슬라이드에 단단히 부착되어 누출을 방지하는지 확인합니다.
메모: 커버슬립이 파손되거나 깨지지 않도록 슬라이드의 채널을 누르지 마십시오.
- 슬라이드를 다시 뒤집고 어셈블리의 외부 슬라이드 쪽에 있는 이중층 주위에 영구 마커가 있는 4개의 점을 그려 커버슬립과 채널 슬라이드 사이에 물방울처럼 보이는 형성된 이중층의 위치를 표시합니다.
- 액체를 채널에 처음 주입하기 전에 채널의 한 포트를 입구 포트로 지정하고 다른 포트를 출구 포트로 지정하고 실험 내내 이 지정을 유지합니다.
- 기포가 형성되는 것을 방지하려면 피펫 팁의 끝을 채널의 입구 포트에 직접 삽입하십시오. 슬라이드의 채널을 50μL의 따뜻한(최소 실온) 분석 버퍼로 천천히 채웁니다(버퍼 조성은 1.5단계 참조).
- 0.5M 염화니켈(II) 용액을 준비합니다. 37°C의 수조에서 2mL의 카제인 용액을 30분 동안 해동하고 최종 농도 200μM의 염화니켈 용액을 보충합니다.
- 먼저 채널의 입구 포트에 100μL의 카제인 용액을 주입한 다음 피펫팅으로 슬라이드의 출구 포트에서 100μL를 즉시 제거하여 이중층을 세척합니다. 각 채널의 입구 포트에 100μL의 카제인 용액을 주입하고 실온에서 45분 동안 슬라이드를 배양하여 동일한 용액으로 이중층을 차단합니다.
- Cy5-ICAM-1-His6 및 스트렙타비딘 단백질의 분취량을 해동합니다. 분석 버퍼의 단백질을 각각 2μg/mL의 최종 농도로 결합합니다. 용액을 20,000 x g 및 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 응집체를 제거합니다.
- 피펫팅으로 슬라이드 채널의 출구 포트에서 나머지 차단 용액을 제거합니다. ICAM-1 및 스트렙타비딘이 포함된 용액 100μL를 입구 포트에 주입합니다.
- 실온에서 45분 동안 슬라이드를 배양합니다. 출구 포트에서 과도한 단백질 용액을 제거합니다. 먼저 채널의 입구 포트에 100μL의 분석 버퍼를 주입한 다음 출구 포트에서 100μL를 즉시 제거하여 이중층을 2x 세척합니다.
- Alexa-Fluor-488 표지 항-CD3 항체를 분석 버퍼로 최종 농도 2μg/mL로 희석합니다. 100μL의 항체 용액을 슬라이드의 입구 포트에 주입하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 출구 포트에서 과도한 단백질 용액을 제거합니다. 3.11단계에서와 같이 100μL의 분석 버퍼로 이중층을 2x 세척합니다.
4. T 세포와 평면 이중층의 상호 작용 이미징
- 예열tage와 컨포칼 또는 TIRF(전반사 형광) 현미경의 대물렌즈는 온도가 37°C에서 평형을 이룰 때까지 가열된 stage에 이중층으로 슬라이드를 설정합니다. 잉크 표시에 따라 스테이지를 적절한 위치로 이동하고 Cy 표지된 ICAM-1 분자의 형광을 사용하는 이중층에 초점을 맞춥니다.
- 컨포칼 현미경의 경우 61X 대물렌즈를 사용하고, TIRF 현미경의 경우 100X 대물렌즈를 적절한 필터 설정과 함께 사용합니다.
- TIRF 현미경 검사에 의한 과립 방출 이미징의 경우, 세포를 엔트리 포트에 주입하기 전에 Alexa-Fluor-568 표지된 anti-CD107a 항체 Fab 단편을 최종 농도 4μg/mL로 세포 현탁액에 추가합니다.
- LN PB 또는 제대혈에서 분리한 준비된 CD4+ T 세포를 재현탁하고 이중층을 포함하는 슬라이드 채널의 진입 포트에 50μL의 세포 현탁액을 주입합니다.
- 원하는 필드 수를 선택하고 주입 후 30분 동안 2분마다 1회씩 각 필드의 이미지를 기록합니다.
- 컨포칼 현미경의 명시야, 반사광 및 형광 채널(Alexa 488 및 Cy5)을 활용하여 이미지를 획득합니다. TIRF 현미경에서 Alexa-Fluor-488 및 Alexa-Fluor-568 형광에는 TIRF 모드를, Cy5 형광에는 광시야 모드를 사용하고, 명시야 이미징을 사용할 수 있습니다.