방법 논문

수지상 세포와 CD4+ T 세포 사이의 상호 작용에 대한 면역조절 약리학적 제제의 효과

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Wei, H., et al. 쥐 내성 수지상 세포의 개발 및 기능적 특성화. J. Vis. 특급 (135), (2018).

이 동영상은 면역조절 약리제를 사용하여 수지상 세포(DC)를 허용 DC(TolDC)로 변환하는 방법을 보여줍니다. 이 변환은 CD4+ T 세포에 대한 면역억제 효과를 통해 TolDC 기능을 평가하여 확인됩니다.

프로토콜

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1. In Vitro 및 In Vivo의 TolDC 기능 평가

  1. T-cell Syngeneic Proliferation Assay(T 세포 신유전자 증식 분석)
    1. 고압증기멸균을 통해 모든 수술 기구를 멸균하고 적절한 안전 절차를 통해 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 실험을 수행합니다.
    2. 500ml PBS에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM EDTA를 사용하여 MACS 완충액을 준비합니다. 0.2μm 필터를 통해 필터링하여 버퍼를 살균합니다.
      메모: 다음 실험을 하는 동안 버퍼를 얼음 위에 두십시오.
    3. CD4+ T 세포를 얻으려면 CO2 챔버를 사용하여 생후 8-10주령의 OT-II T 세포 수용체(TCR) 형질전환 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 해부 보드에 놓고 70% 에탄올로 헹굽니다. 수술용 가위와 집게를 사용하여 복부 왼쪽에서 비장을 분리하십시오.
    4. 6cm 배양 접시에 PBS 2ml가 든 비장을 넣고 3ml 주사기의 푸시 스틱 뒷면을 사용하여 40μm 세포 여과기를 통과시켜 비장을 다집니다.
    5. 세포 현탁액과 원심분리를 300 x g에서 5분 동안 수집합니다.
    6. 세포 펠렛을 400μl의 MACS 완충액에 재현탁합니다.
    7. CD4+ T 세포 비오틴-항체 칵테일 100μl를 4°C에서 5분 동안 추가합니다.
      메모: 항체 칵테일은 CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R(B220), CD49b(DX5), CD105, Anti-MHC class II, Ter-119 및 TCRγ/δ와 같은 CD4+ T 세포를 제외한 다른 세포 유형에 결합합니다.
    8. 300μl의 MACS 버퍼와 200μl의 Anti-Biotin beads(재료 표)를 4°C에서 10분 동안 추가합니다.
    9. 강자성구(Table of Materials)와 Pre-Separation Filter로 구성된 컬럼을 자기장에 함께 놓고 MACS 버퍼 3ml로 헹굽니다.
    10. 세포에 MACS 완충액 9ml를 추가하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    11. 세포 펠릿을 MACS 완충액 3ml에 재현탁하고 컬럼에 적용합니다. CD4+ T 세포를 포함하는 플로우 스루(flow-through)를 수집합니다.
    12. 또 다른 3ml의 MACS 버퍼로 컬럼을 세척하고 플로우스루(flow-through)도 수집합니다.
    13. 비장 팬 DC를 얻으려면 CO2 챔버를 사용하여 생후 8-10주령의 C57BL/6 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 해부 보드에 놓고 70% 에탄올로 헹굽니다. 수술용 가위와 집게를 사용하여 복부 왼쪽에서 비장을 분리하십시오. 콜라겐 분해 효소 D 용액 2ml(칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS에 용해된 콜라겐 분해 효소 D 2mg/ml)가 들어 있는 6cm 배양 접시에 비장을 넣습니다.
    14. 콜라겐분해효소 D 용액 1ml를 주사기 1ml와 바늘 25G로 비장에 2회 주사합니다. 작은 가위로 비장을 작은 조각으로 자릅니다.
    15. 흔들어 실온에서 25분 동안 배양합니다.
    16. 실온에서 5분 동안 0.5M EDTA 500μl를 추가합니다.
      메모: 1.1.13-1.1.14의 단계는 DC의 수율을 높이는 데 중요합니다.
    17. 이제 3ml 주사기의 푸시 스틱 뒷면을 사용하여 40μm 세포 여과기를 통과시켜 비장 슬러리를 다진 다음 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 현탁액을 수집합니다.
    18. 세포 펠릿을 MACS 완충액 350μl, FcR 차단 시약 50μl, 팬 수지상 세포 비오틴-항체 칵테일 100μl에 4°C에서 10분 동안 재현탁합니다.
      메모: DC에 의해 발현되지 않는 항원에 대한 항체 칵테일.
    19. MACS 완충액 9ml와 원심분리기를 300 x g에서 5분 동안 첨가하여 세포를 세척합니다.
    20. 세포 펠릿을 800μl의 MACS buffer에 재현탁시키고 200μl의 Anti-Biotin beads를 4°C에서 10분 동안 첨가합니다.
    21. 1.1.9-1.1.11의 단계를 반복하여 DC를 수집합니다.
    22. 다른 3ml의 MACS 버퍼로 컬럼을 두 번 세척하고 플로우스루도 수집합니다.
    23. 100-400 nM CDDO-DFPA의 유무 상태에서 37°C에서 1시간 동안 2 x 105 DCs/ml를 처리합니다. 별도로 CD4+ T 세포(1 x 107/ml)에 37°C에서 15분 동안 1μM CFSE로 라벨을 붙이고 PBS로 세척한 다음 부피를 재조정하여 2 x 106 T cells/ml에서 최종 농도를 얻습니다.
    24. 다음으로, 96-웰 플레이트에서 처리된 수지상 세포 100μl를 동일한 부피의 CFSE 표지 CD4+ T 세포와 함께 공동 배양하며, 둘 다 위의 단계에서 수집하여 1:10 비율을 얻습니다. 이제 웰당 100ng/mL 오브알부민(OVA) 펩타이드 323-329를 추가하고 배양 2-3일 후 유세포 분석으로 T 세포의 CFSE 강도를 측정합니다.
      메모: DC와 T 세포의 세포 수와 비율은 이전 연구에서 최적화되었습니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CDDO-DFPA(RTA-408)레아타 제약사내 합성세포 배양
마우스 GM-CSF주식회사 페프로텍315-03BMDC 차별화
팬 수지상 세포 분리 키트Miltenyi Biotec Inc.Tel.: 130-100-875T 세포 증식 분석
Pan Dendritic Cell 비오틴-항체 칵테일Miltenyi Biotec Inc.Tel.: 130-100-875T 세포 증식 분석
CD4+ T 세포 분리 키트밀테니 바이오텍 IncTel.: 130-104-454T 세포 증식 분석
증권 시세바이오레전드423801T 세포 증식 분석
FcR 차단 시약Miltenyi Biotec Inc.Tel.: 130-100-875T 세포 증식 분석
안티 비오틴 마이크로비즈Miltenyi Biotec Inc.Tel.: 130-104-454T 세포 증식 분석
주사기 1mlBD 바이오사이언스309626T 세포 증식 분석
증권 시세시그마 알드리치 IncA2058 (영어T 세포 증식 분석
에디타써모피셔 사이언티픽15575020T 세포 증식 분석
LS 컬럼Miltenyi Biotec Inc.Tel.: 130-042-401T 세포 증식 분석
사전 분리 필터밀테니 바이오텍 IncTel.: 130-095-823T 세포 증식 분석
콜라겐분해효소 D시그마 알드리치 Inc.11088858001T 세포 증식 분석
HBSS (하이브에스)써모피셔 사이언티픽14025076T 세포 증식 분석
오브알부민(OVA) 펩타이드 323–329시그마 알드리치 Inc.O1641T 세포 증식 분석
년 표시기 표시기 )

재인쇄 및 허가

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태그

MHC IICFSET

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