비만 세포에서 분비 과립의 외세포작용(Exocytosis)을 시각화하기 위한 체외 기술(An In vitro technique to visualize exocytosis of secretory granules in mast cells)

초록

출처: Klein, O., et al. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 비만 세포에서 외포작용(exocytosis)을 시각화하는 기술을 보여줍니다. 세포는 형광 리포터인 FITC-dextran으로 배양되며, 이는 산성 pH가 형광을 소멸시키는 분비 과립(SG) 내부의 세포에 의해 흡수됩니다. 과립 엑소사이토시스(granule exocytosis)가 자극되면 배지의 더 높은 pH는 융합된 SG 내부의 리포터 형광을 유도하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

프로토콜

1. 준비

사항

1. RBL(RBL-2H3 비만 세포주) 배양 배지 준비
   1. 저혈당 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 500mL와 소 태아 혈청(FBS) 56mL, 페니실린-스트렙토마이신-니스타틴 용액 5.5mL, L-글루타민 200mM 용액 5.5mL를 혼합합니다. 그 결과 10% FBS, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100단위/mL 페니실린, 12단위/mL 니스타틴 및 2mM L-글루타민이 보충된 저혈당 DMEM이 생성됩니다.
   2. 0.22μm 공극 크기의 상단 진공 필터를 사용하여 매체를 필터링하고 4°C에서 보관합니다.
2. RBL 세포의 유지.
   1. 10cm 접시에서 RBL 세포를 최대 90%의 포화도까지 성장시킵니다. 세포 배양이 건강하다면 세포는 가끔 돌출된 방추체 모양을 가져야 합니다.
   2. 세포 분할을 위해 배지를 흡인하고 2mL의 트립신/EDTA 용액 B로 교체하여 접시에서 세포를 분리합니다. 37°C에서 5% CO₂의 가습된 분위기에서 5-10분 동안 배양합니다.
   3. 세포가 분리되면 피펫을 사용하여 2mL의 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화하고 세포를 1:2 - 1:10 비율로 분할합니다.
3. 20x Tyrode의 버퍼 준비
   1. 이중 증류수(DDW)에서 54mM KCl, 20mM MgCl₂, 2.74M NaCl 및 8mM NaH_2PO4의 스톡 20x 용액을 준비합니다. 잘 섞어 4 °C에서 보관하십시오.

2. 생세포 현미경 검사를 위한 RBL 세포 배양

1. FITC-덱스트란 용액의 제조.
   1. 배양 배지 1mL당 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란 분말(150K) 1mg을 혼합합니다(1.1.1 단계 참조). 전체 챔버 커버 글라스의 경우 3mL를 준비합니다.
   2. 공극 크기가 0.22μm인 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터 장치를 사용하여 용해된 FITC-덱스트란을 여과합니다.
   3. 마우스 면역글로불린 E(IgE)를 1μg/mL 농도에 첨가합니다.
2. 이미징을 위한 RBL 세포 파종
   1. 이미징 전날, 배양 접시에서 배지를 흡인하고 2mL의 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액 B로 교체합니다. 37°C에서 5%_CO2의 가습 분위기에서 5 - 10분 동안 배양합니다. 세포가 분리되면 2mL의 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
   2. 혈구계를 사용하여 RBL 세포를 계수하고 배양 배지에 따라 부피를 조정하여 7.5 x 10⁵/mL의 세포 농도를 얻습니다.
   3. 새로운 FITC-dextran 보충 배양 배지로 미리 채워진 챔버 커버 글라스에 세포 현탁액 10μL를 추가합니다(이로 인해 챔버에서 7.5 x 10³ 세포가 파종됩니다).
   4. 37°C에서 5% CO₂의 완화된 분위기에서 밤새 RBL 세포를 성장시킵니다. 세포는 세포가 분리되어 있고 현미경으로 각 세포를 개별적으로 쉽게 식별할 수 있도록 하위 농도 수준으로 유지되어야 합니다.
3. RBL 세포의 transfection - 선택 사항.
   1. 다른 형광 표지 단백질과 조합하여 외래 이벤트를 이미징하려면 Azouz 등의 RBL 세포에 대한 transfection protocol을 참조하십시오.

3. Exocytosis의 라이브 셀 현미경 검사

1. 솔루션 준비 :
   1. DDW의 원액을 1:20 희석으로 희석하여 최종 Tyrode's 완충 용액을 준비하고 20mM Hepes pH 7, 1.8mM CaCl₂, 1mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 및 5.6mM 포도당을 보충합니다.
   2. Tyrode의 완충액[본 사례의 경우 인간 혈청 알부민(DNP-HAS (Ag))에 접합된 1μg/mL 디니트로페닐, 50ng/mL 1x 농도]에 20x secretagogue 시약을 새로 준비합니다.
   3. Tyrode의 완충액에 분말을 용해하여 400mM 염화암모늄 용액을 준비합니다.
2. 세포의 준비.
   1. 챔버에서 매체를 흡인하고 37°C로 예열된 300μL의 Tyrode 완충액으로 다시 채워 챔버 커버 유리를 3회 세척합니다. 마지막으로, 37°C로 예열된 300μL의 Tyrode 완충액을 챔버에 보충합니다.
   2. 챔버가 있는 커버 유리를 현미경의 인큐베이터 챔버에 놓습니다. 챔버가 안정적인지 확인하십시오.
3. 현미경 설정
   1. 추적할 관심 영역을 선택하려면 형광등(전통적으로 수은 램프)을 켜고 적절한 형광 필터를 선택합니다(FITC-dextran을 보기 위해 녹색 형광단에 대한 필터 선택). 관심 영역에 초점이 맞춰지고 시야의 중앙에 있으면 광표백 및 독성을 방지하기 위해 광원을 끕니다.
      참고: 세포에 통합된 일부 FITC-dextran은 형광을 유지할 수 있습니다. 이는 FITC-dextran이 엔도솜과 같은 비-리소좀 compartment로 분류될 수도 있기 때문입니다.
   2. FITC 가진에 적합한 조명을 켭니다. 레이저 기반 현미경을 사용하는 경우 488nm 레이저를 켭니다. 방출은 약 500 - 550 nm에서 수집되어야 합니다(FITC 방출은 510 - 520 nm에서 최고조에 달함).
   3. 컨포칼 현미경을 사용할 때는 핀홀을 최대로 엽니다. 이를 통해 더 낮은 레이저 출력을 사용하여 표백 및 독성을 방지할 수 있으며 세포의 모든 평면에서 exocytosis 이벤트를 캡처할 수 있습니다.
   4. 이미지 획득 사이의 시간 간격을 보정합니다.
      1. 다른 세포는 조절된 외세포작용의 동역학이 다를 수 있습니다. 복합 엑소사이토시스의 특정 이미징을 위해서는 최소 5초의 시간 간격을 권장합니다. 그러나 일반적으로 빠른 이미징을 허용하려면 단일 프레임의 획득 시간이 빠르지 않은지 확인하십시오.
      2. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하는 경우 스캔 방향을 양방향으로 설정하고 평균화를 허용하지 않으며 해상도를 512 x 512로 설정합니다(권장, 후자의 두 조항은 표백 및 독성을 최소화하는 데도 도움이 됨).
4. exocytosis의 이미징.
   1. 세포 또는 분비물의 유형에 따라 원하는 기간 동안 이미지를 촬영할 수 있습니다. IgE/Ag로 촉발된 RBL 세포에서 대부분의 외래 현상은 활성화 후 15-20분 이내에 발생합니다.
   2. 세포 활성화를 위해 20x secretagogue 용액의 16μL를 챔버에 추가합니다.
5. 세포 내 FITC-dextran 존재 확인.
   1. SG에 대한 FITC-dextran의 존재 및 국소화를 확인하기 위해 16μL의 염화암모늄 용액(초점을 잃지 않도록 챔버를 움직이지 않도록 주의)을 챔버에 부드럽게 추가합니다(이렇게 하면 최종 농도가 20mM가 됩니다). 이는 SG의 알칼리화를 유도하고 FITC 형광을 디퀜칭(dequenching)하여 몇 초 내에 발생합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM 저포도당	생물학적 인덕트리	01-050-1ᄀ
소 태아 세럼	지브코	12657
Pen-strep-nystatin 용액	생물학적 인덕트리	03-032-1B
L-글루타민 200mM 용액	생물학적 인덕트리	03-020-1ᄀ
FITC 덱스트란 150K	시그마-알드리치	46946-500MG-F
트립신/EDTA 용액 B	생물학적 인덕트리	03-052-1ᄀ	사용 전 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오
0.22μm 공극 크기의 상부 진공 필터	시그마-알드리치	CLS430769-1개
셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터 장치, 0.22μm 기공 크기	싸토리우스	16534케이
챔버 커버 유리	써모 사이언티픽	155411
코닝의 조직 배양 처리 배양 접시	시그마-알드리치	CLS430167
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A4503
항DNP 단클론 IgE	시그마-알드리치	D8406
DNP-HSA(아그)	시그마-알드리치	A6661	직사광선 노출을 피하십시오
헥스 완충액 1M, pH 7.4	생물학적 인덕트리	03-025-1B
염화칼슘2	메르크	102382
포도당	BDH 연구소	284515V
염화암모늄	메르크	1145
PIPES 이칼륨 염	시그마-알드리치	제108321-27-3
칼슘 아세테이트 수화물	시그마-알드리치	114460-21-8
마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트	시그마-알드리치	M5661
글루타민산 칼륨 (L- 글루탐산 칼륨 염 일 수화물)	시그마-알드리치	G1501
나H2PO4	메르크	6346
염화나트륨	메르크	106404
재질 보기 MgCl2	메르크	105833
케이클	메르크	104936
전기포레이터	증권 시세	ECM830
컨포칼 현미경, Zeiss	자이스	LSM 5 파스칼, 액시오베르트 200M	그림 3에 사용됩니다. 전자 온도 제어 장치 장착
Airstream 인큐베이터
컨포칼 현미경, Zeiss	자이스	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	그림 2에 사용됩니다. GaAsP 검출기, 전자식 온도 제어
Airstream 인큐베이터
컨포칼 현미경, Leica	라이카	SP5	그림 1에 사용됩니다. 라이카 HyD 검출기와 최상급 인큐베이터(okolab) 장착
RBL-2H3 셀			RBL-2H3 세포는 Reuben P. Siraganian의 실험실에서 클로닝되었습니다. 참조 67 참조

년 . . 년 호 표시기 시리즈 장치 장착 시리즈