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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. PEGylated Lipid에 대한 단백질 항원의 접합
- 분획 범위가 1,500–30,000 Daltons(Da)인 가교 덱스트란 겔 비드 3g을 250mL 진공 플라스크에 추가합니다. 60mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 넣고 마그네틱 교반 막대로 계속 저어줍니다. 플라스크를 밀봉하고 진공 청소기에 부착하여 최소 1시간 동안 교반 플레이트에서 가스 제거를 시작합니다.
- 턴오버 스토퍼가 닫힌 상태에서 1.0cm x 30cm 유리 크로마토그래피 컬럼에서 PBS를 컬럼에 추가하여 세척합니다. 턴오버 스토퍼를 열고 컬럼을 배수합니다. 세척 후 가스가 제거된 비드의 슬러리를 컬럼에 추가합니다. 컬럼이 약 24cm의 비드 높이로 채워질 때까지 슬러리를 계속 첨가합니다.
- 포장된 비드 위에 약 4-5cm의 PBS '헤드'가 컬럼에 있으면 다음 단계를 준비합니다.
- 컬럼 상단에서 1-2피트 높이의 선반에 도달할 수 있을 만큼 충분히 긴 튜브 조각을 측정하여 중력 흐름 사이펀을 만들고 컬럼 하단 근처에 떨어지고 컬럼 상단으로 돌아가는 루프를 만듭니다. 튜브의 한쪽 끝을 열어 두고 튜브의 한쪽 끝을 열어 둡니다. 열린 튜브 끝을 500mL PBS 병에 넣고 컬럼 위의 선반에 놓습니다.
- 턴오버 스토퍼로 끝을 잡고 10mL 주사기를 부착합니다. 튜빙 라인의 턴오버 스토퍼 밸브를 열고 튜브를 통해 PBS를 끌어들입니다. PBS가 튜브를 통과하는 방법의 3/4에 도달하면 주사기를 빠르게 제거하고 컬럼 상단에 턴오버 스토퍼를 추가합니다. 액체가 컬럼으로 흘러야 합니다.
참고: 컬럼 상단에 남아 있는 PBS의 '헤드'의 양은 1cm에서 3cm 사이여야 합니다. 컬럼을 세척하는 데 필요한 최소 용량은 3 컬럼 부피입니다.
- 분자량(MW)을 기준으로 지질에 연결할 단백질(몰)의 양을 결정합니다.
참고: 염소 항-마우스 면역글로불린, IgM(그 자체로 IgG)의 Fab 단편은 B 세포의 다클론 자극을 위한 범용 대리 항원으로 사용됩니다. 따라서, 염소 IgG의 Fab 단편은 약 48 킬로달톤(kDa)의 MW를 가지며 총 1.3 mg의 양으로 상업적으로 이용 가능합니다. 따라서 연결할 단백질의 양은 27.1μmol입니다.
- 관심 단백질의 흡광 계수를 결정합니다. 알 수 없는 경우 분광 광도계를 사용하여 280nm에서 단백질 흡광도를 측정하고 A280 값을 1.4.
단계에서 계산된 몰 수로 나눕니다.
참고: 280nm에서 염소 IgG의 Fab의 흡광 계수는 64,600M-1입니다.
- 미량의 아민 함유 완충액이 제거되도록 하려면 1.1–1.3단계에서 생성된 컬럼의 단백질을 탈염하고 단백질 분획을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브(분획당 ~500μL)에 수집합니다.
- 컬럼 상단에 연결된 턴오버 스토퍼 밸브를 닫고 컬럼 상단을 제거합니다. 아직 열리지 않은 경우 컬럼 하단의 턴오버 스토퍼 밸브를 열고 PBS의 '헤드'가 비드 상단에 닿을 때까지 기다립니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 관심 단백질을 비드 상단에 천천히 첨가하고 비드 상단의 방해를 최소화하도록 주의하십시오.
- 단백질 용액의 '헤드'가 비드 상단에 도달하면 파스퇴르 피펫을 통해 PBS 1mL를 부드럽게 첨가합니다. 세 번 반복합니다. PBS를 추가하여 4-5cm의 머리를 만들고 1.3단계를 반복하여 컬럼을 세척합니다.
참고: 아민 함유 버퍼가 없는 것이 확실한 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
- A280 값을 측정하여 단백질을 포함하는 분획을 결정하고 단백질의 약 90% 회수율을 제공하는 분획을 풀링합니다.
참고: 이것은 일반적으로 단백질을 1.5-2배 희석합니다. 풀링(pooling) 후 단백질 농도를 측정합니다. 필요한 경우 원심분리 농축기를 사용하여 이 단계에서 단백질을 농축합니다.
- 단백질에 이종작용기 교차결합제(heterobifunctional crosslinker)에 해당하는 2.5몰을 추가합니다.
- 먼저 약 5mg의 숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP, MW = 314g/mol)의 무게를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. SPDP를 용해시킬 부피를 결정하려면 어금니 단백질 농도와 250x를 takmultiplye하여 반응에서 2.5몰 초과를 제공하는 100x 용액을 생성합니다.
참고: 예를 들어, 단백질 농도가 50μM인 경우 12.5mM에서 SPDP 용액이 필요합니다. SPDP 5mg의 경우 이는 디메틸설폭사이드(DMSO) 1.27mL에 해당합니다.
- 관심 단백질에 SPDP를 1:100 희석으로 첨가합니다. 실온(RT)에서 약 1시간 동안 진동 셰이커에 반응을 놓습니다.
- 과도한 SPDP를 제거하고 내인성 이황화 결합을 보호하기 위해 후속 환원 단계에서 단백질에서 pH 5.5의 100mM 아세트산나트륨(NaOAc)에서 1.1–1.3단계에서 생성된 컬럼을 평형화하고 세척하거나 이 완충액에만 사용하기 위한 동일한 컬럼을 생성합니다.
- SPDP로 1시간 배양 후 100mM NaOAc에서 평형을 이룬 컬럼의 단백질을 탈염합니다. 100mM NaOAc(pH 5.5)를 용리액으로 사용하는 것을 제외하고는 1.6단계와 동일한 방식으로 이 단계를 수행합니다. 분수를 모으고, A280을 결정하고, 상위 분수를 합칩니다. PBS에서 컬럼을 세척합니다.
- 이중 증류수(ddH2O)에 2.5M의 DTT(MW = 154g/mol) 용액을 준비합니다. 5-10분 동안 단백질의 풀링된 분획에 25mM DTT를 추가합니다.
- 단백질의 A280을 측정하고 이를 소광 계수로 나눕니다. 또한 A343을 결정하십시오. 단백질(A280)과 링커(A343)의 몰 농도를 기준으로 연결 비율을 계산합니다.
알림: 나노드롭 분광 광도계를 사용하는 경우 A340 자동 보정을 끕니다. A343 측정은 DTT에 의해 SPDP 가교제에서 제거된 피리딘 2-티온기(흡광 계수 = 7550 M-1)의 흡광도를 나타냅니다. 링커의 몰 비율 : 단백질 비율 1.2-1.5는 일반적으로 광범위한 단백질에서 2.5 몰 초과의 SDPD로 반응을 수행 할 때 달성됩니다.
- 위에서 설명한 대로 PBS에서 세척된 컬럼 위에 합동 분수를 실행합니다. 분수를 모으고, A280을 결정하고, 상위 분수를 풀합니다. 분획을 모은 후 A280으로 단백질의 농도를 결정합니다.
- DSPE-PEG(2000)-말레이미드(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000)-말레이미드를 준비합니다. 이것은 10:1 몰 비율로 단백질에 추가됩니다. 원하는 농도를 달성하기 위해 DSPE-PEG(2000)-Maleimide 100배 스톡을 준비합니다.
- 예를 들어, 1.14단계 후 단백질 농도가 10μM인 경우 10mM에서 DSPE-PEG(2000)-Maleimide 스톡을 준비합니다. DSPE-PEG(2000)-말레이미드(MW = 3000g/mol)의 무게를 조심스럽게 측정하고 적절한 양의 DMSO를 첨가합니다. 여러 차례의 부드러운 소용돌이와 초음파 처리는 완전히 용해 될 수 있습니다.
- 1.14단계에서 분획의 총 부피를 측정하고 용액을 작은(10-25mL) 둥근 바닥 플라스크(RBF)에 조심스럽게 옮깁니다. 단백질에 적당량의 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimide를 첨가하여 1x, 10배 몰 초과, 최종 농도를 얻습니다. 용액을 부드럽게 소용돌이쳐 DMSO가 완전히 분산되도록 합니다.
- 밀봉된 RBF에서 질소 하에서 밤새 반응을 실행합니다. 고무 격막을 사용하여 흄 후드에 넣으십시오.
- 진공 청소기에 부착된 튜브 끝에 있는 3mL 주사기에 20G 바늘을 부착하여 중격에 구멍을 뚫어 대기를 제거하고 3-5초 동안 진공 청소기를 켭니다.
- 대기를 질소로 교체하십시오. 반으로 자른 3mL 주사기에 부착된 풍선에 질소를 채우고 20G 바늘을 부착합니다. 격막에 구멍을 뚫어 둥근 바닥 플라스크 내부의 대기를 질소로 채웁니다. 대기 제거와 질소 교체를 한 번 더 반복하고 질소 풍선을 밤새 부착 한 상태로 두십시오.
- 1.0cm x 50cm 유리 크로마토그래피 컬럼에서 분획 범위가 4,000–150,000Da인 별도의 가교 결합된 덱스트란 겔 비드 컬럼을 준비합니다(1.1-1.3 단계에 따름).
- 다음 날, 1.17단계에서 준비한 둥근 바닥 플라스크에서 단백질을 제거하고 가교 결합된 dextran gel bead 컬럼(1.18단계)을 실행합니다(1.6단계에서 사용된 방법 따름).
참고: 컬럼에 로드할 총 양은 2mL를 넘지 않아야 합니다. 더 큰 반응이 사용된 경우 둘로 분할하여 별도의 컬럼에서 실행하거나 더 큰 직경의 컬럼에서 실행하십시오.
- 분획을 수집하고, A280을 측정하고, 상위 분획을 풀링하고, 단백질의 농도를 측정합니다. 지질의 존재는 측정에 영향을 미치지 않습니다.
- 지질 결합 단백질의 최종 풀링된 분획을 사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관합니다.
2. 리포좀 제제
- 지질의 무게를 잰다: DSPE-PEG(2000) (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000, MW = 2805.5 g/mol; 콜레스테롤 (3b-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g / mol; 및 DSPC (1,2- 디스테아로 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 콜린), MW = 790.1 g / mol. 클로로포름에 DSPC 5mg/mL 용액, 콜레스테롤 4mg/mL 용액, DSPE-PEG(2000) 2mg/mL 용액을 만듭니다.
- 표 1.
와 같이 리포솜 내 지질의 몰 비율이 57% DSPC, 38% 콜레스테롤 및 5% DSPE-PEG(2000)인지 확인합니다.
참고: 일반적으로 0.01–0.1% 범위의 리포솜에 있는 항원의 양을 조절하는 것이 중요합니다. 표 1에서는 PEGylated lipid에 연결된 염소 anti-mouse IgM Fab 단편 0.1%를 사용합니다. PEGylated 지질의 총량이 5%를 초과하지 않도록 1.15단계에서 단백질에 첨가된 DSPE-PEG(2000)-Maleimide의 10배 몰 초과량을 고려하는 것이 중요합니다.
- 압출을 위한 지질을 생성할 때 최종 지질량(μmol)을 고려하십시오. 1.25μM 총 지질 농도에서 리포좀을 생성하기 위한 몰 지질 농도를 계산하는 예는 표 1을 참조하십시오.
- 함께 추가할 각 지질의 정확한 양이 계산되면 모두 12mL 붕규산 유리 시험관에 결합합니다.
- 클로로포름을 조심스럽게 불어냅니다.
- 1.17.1단계에서 준비한 바늘이 달린 튜브와 3mL 주사기를 사용하여 튜브의 클로로포름을 질소로 조심스럽게 불어냅니다. 다른 손으로 튜브를 회전시키면서 용액에 질소 흐름을 부드럽게 불어 넣습니다. 다음 단계에서 액체를 용액으로 만드는 것이 더 어려울 수 있으므로 액체가 튀거나 튜브 측면으로 흘러내리는 것을 최소화하도록 주의하십시오.
- 각 튜브에 100μL의 DMSO를 첨가하고 이 용액을 밤새 동결건조합니다. 튜브의 상단을 비정전기 실험실 물티슈로 덮고 고무 밴드로 고정한 다음 -80 °C에서 동결합니다.
3. 리포좀 압출
- 지질이 포함된 12mL 튜브에 지질 결합 단백질이 포함된 PBS 1mL를 추가합니다. 초음파 처리 수조에서 약 30초에서 1분 동안 용액을 초음파 처리합니다. 각 라운드 사이에 5분 이상 휴식을 취하고 3-4회 반복합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 압출기를 준비하십시오.
- 내부 멤브레인 지지대에 필터 지지대를 추가하고 파라핀 필름에 PBS 몇 방울(각 10μL)을 떨어뜨립니다. 핀셋을 사용하여 필터 지지대의 가장자리를 잡고 10μL 방울에 담그십시오.
- 필터를 O-링 내부에 놓습니다. 양쪽 모두에 대해 이 작업을 수행합니다. 핀셋을 사용하여 10μL 드롭의 가장자리 딥에서 0.8μm 필터를 잡고 O-링 외부를 PBS로 코팅합니다. 0.8μm 필터를 O-링에 부드럽게 올려 필터가 내부 멤브레인 지지대를 벗어나지 않도록 합니다.
- 압출기 가열 블록을 핫 플레이트에 올려 압출기를 예열합니다. 핫플레이트를 낮게 켜고 압출기 가열 블록이 원하는 온도에 도달하도록 합니다. 단백질 응집과 관련된 잠재적인 문제를 방지하려면 블록을 37°C 이상으로 가열하지 마십시오.
- 초음파 처리된 샘플을 압출기에 배치된 압출 주사기 중 하나에 로드합니다. 압출기 주사기를 압출기의 다른 쪽 끝에 놓습니다. 빈 주사기 플런저가 0으로 설정되어 있는지 확인합니다. 지질이 폴리카보네이트 0.8μm 멤브레인을 통해 압출될 때 빈 주사기가 채워집니다. 멤브레인을 통해 거품이 앞뒤로 전달되지 않도록 하십시오.
- 완전히 조립된 압출기를 가열 블록에 놓습니다. 지질이 채워진 주사기의 플런저를 빈 주사기로 부드럽게 밀어 넣습니다. 지질 농도에 따라 이를 통과하기 어려울 수 있습니다. 20회 반복합니다.
- 가열 블록에서 완전히 조립된 압출기를 제거합니다. 압출기에서 채워진 주사기를 천천히 제거하고 제거할 때 누출될 수 있는 지질을 모두 수집하십시오. 깨끗한 바이알에 리포솜을 넣습니다. 폴리카보네이트 0.2μm 및 0.1μm 멤브레인을 사용하여 3.4–3.6단계를 반복합니다.
- PBS에서 평형을 이룬 0.7-10 Mega Daltons(MDa)의 분리 범위를 가진 0.7 x 50cm2 가교 결합 아가로스 비드 컬럼을 생성합니다. 리포좀을 추가하고 1.6단계와 같이 실행합니다. 리포좀을 함유한 분획은 250–400nm 범위에서 광 투과율이 감소합니다.
- 리포좀은 4°C에서 보관하고 얼지 마십시오.
4. 항원 리포좀에 의한 B 세포 활성화를 모니터링하기위한 칼슘 플럭
스
- 기관 표준 운영 절차에 따라 이산화탄소(CO2) 또는 이소플루란 과다 투여로 마우스를 안락사시킵니다. 경추 탈구에 의한 마우스의 안락사를 확인합니다.
- 수술 기구와 생쥐 사체를 70% 에탄올을 사용하여 살균합니다. 길이 10cm, 끝 0.8mm의 곡선형 홍채 집게를 사용하여 흉강을 덮고 있는 피부와 흉곽을 분리합니다. 10cm 길이의 곧은 절개 가위를 사용하여 양측 절개로 원위 절개를 만듭니다.
- 구부러진 홍채 집게와 해부 가위를 사용하여 복강에서 비장을 추출합니다. 비장을 둘러싼 지방 조직을 제거한 다음 1% 태아 송아지 혈청(FCS)과 페니실린-스트렙토마이신RPMI1640 포함된 배지로 채워진 15mL 폴리스티렌 원뿔형 튜브에 넣습니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에 장착된 40μm 세포 여과기를 통해 비장과 배지를 이동합니다. 3mL 주사기 플런저의 고무 끝을 사용하여 비장을 부드럽게 부수십시오. 40μm 세포 여과기를 배지로 세척합니다. 40μm 세포 스트레이너에 지방 조직만 남을 때까지 이 과정을 반복합니다. 세포 회수율을 높이기 위해 3-5mL의 배지로 체를 헹굽니다.
- 원심분리기 세포는 RT에서 5분 동안 300 x g에서 균질화합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 1x RBC 용해 완충액 10mL를 펠렛에 추가합니다. 피펫을 위아래로 넣고 RT에서 2-3분 동안 방치한 다음 RT에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 적혈구가 고갈된 비장세포를 10mL의 배지에 재현탁합니다. 혈구계(hemocyometer) 또는 다른 세포 계수 장치를 사용하여 총 세포 수를 측정합니다. 위에서 설명한 대로 원심분리로 세포를 펠렛화합니다.
참고: 비장 세포의 Indo-1 로딩에 필요한 이상적인 최종 농도는 10–20 x 106 cells/mL이지만 더 낮은 농도의 세포를 사용할 수 있습니다.
- 칼슘 플럭스 로딩 버퍼(Roswell Park Memorial Institute, 1% FCS, 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 1mM 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N, N,N', N'-테트라아세트산(EGTA) 및 5% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640 배지)에서 비장 세포를 15 x 106 cells/mL로 재현탁시킵니다. 1mM DMSO 원액에서 1.5μM Indo-1을 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 빛을 피하고 37°C 수조에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
- 30분 배양 후 칼슘 플럭스 로딩 버퍼의 5배를 추가합니다. 300 x g에서 상온에서 7분 동안 원심분리기.
- B 세포에 대한 게이팅을 위해 0.5mL의 로딩 버퍼에 1:200 안티 마우스 CD5-PE 및 안티 마우스 1:200 B220-PE/Cy7을 넣고 4°C에서 20분 동안 빛으로부터 보호하여 세포를 염색합니다.
- 칼슘 플럭스 로딩 버퍼와 원심분리기에서 비장세포를 RT에서 7분 동안 300 x g으로 세척합니다. 칼슘 플럭스 러닝 버퍼(1% FCS, 1mM MgCl2 및 1mM 염화칼슘(CaCl2)를 함유한 Hank's balanced salt solution(HBSS))에서 10–20 x 106 cells/mL로 세포를 재현탁합니다. 유세포 분석기에서 작동할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 보관하십시오.
- 보상을 위해 염색되지 않은 단일 염색 제어로 유세포 분석을 설정합니다.
- 염색된 세포를 실행하여 게이트를 적절하게 설정합니다(그림 1A 참조). Indo-1 (violet) 대 Indo-1 (blue) 플롯을 설정하고, Indo-1 채널의 전압을 조정하여 염색 세포를 45–60°의 기울기로 배치하여 신호: Indo-1 violet의 노이즈 비율: B 세포 자극에 따른 비율의 파란색 변화를 최대화합니다.
참고: 전압이 너무 높아서 셀의 상당한 비율(>5%)이 플롯의 맨 위에 올라갈 수 있는지 확인하십시오.
- 플롯의 왼쪽 상단 부분(보라색+파란색-)을 캡슐화하는 대각선 게이트를 생성하여 자극 없이 <세포의 10%가 게이트에 있으며, 이는 자극 후 >75%로 이상적으로 증가해야 합니다.
- 뚜껑이 있는 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브(형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브)에 0.5mL의 세포를 추가하고 수조에서 3-5분 동안 세포를 37°C로 가열합니다. 재순환 수조에 연결된 37°C 방수 챔버에 FACS 튜브를 놓습니다.
- 유세포 분석기의 워터 재킷에 있는 튜브를 실행하고 데이터를 저장하지 않고 약 5,000–10,000 events/s에서 수집을 시작합니다. 세포가 안정화되면(15-30초) 데이터 수집을 시작하고 최소 10초 동안 데이터를 수집하여 배경을 설정합니다.
- 10 콧물 표시에서 유세포분석기에서 튜브를 빠르게 제거하고 자극(2-20 μL의 5-50 μM 항원 리포좀)을 추가하고 펄스 와류를 일으키고 FACS 튜브를 유세포분석기에 다시 넣습니다. 이 시간 동안 데이터 수집 및 저장을 유지하고 3-5분 동안 데이터를 수집합니다.
- kinetics 기능 아래의 적절한 분석 소프트웨어에서 데이터를 분석합니다.
표 1: 1.25μM 총 지질 농도 리포좀을 생성하기 위한 계산.염소 anti-mouse IgM F(ab) 단편 리포좀에 대한 계산표의 예.
명
의
년
년
호
분
분
조
개
분
호
호
호
호
호
호
호
호
호
분
분
명
호
분
분
개
개
개
호
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| 디에스피씨 | 콜레스테롤 | 페그-DSPE | 초과 PEG-DSPE | aIgM-페그-DSPE | 합계 |
| 몰 비율 | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100.00 |
| 질량 (mg) | 0.56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0.06 | 0.98 |
| mmol | 0.71 | 0.47 | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 1.25 |
| 밀리리터 | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| | | 농도 (mg/mL) | | | |
| | 디에스피씨 | 5 | | | |
| | 콜레스테롤 | 4 | | | |
| | 페그-DSPE | 2 | | | |
| | aIgM-페그-DSPE | 0.114 | | | |
