한외여과 장치를 사용한 박테리아 배양 여과 단백질 농도 여과

초록

출처: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포외 소포 농축. J. Vis. 특급 (183) (2022)

이 비디오는 한외여과를 사용하여 박테리아 세포외 소포체를 포함하는 박테리아 배양 여과액 단백질의 분리 및 농축을 보여줍니다. 농축된 세포외 소포체는 질병 감지를 위한 진단 마커 역할을 합니다.

프로토콜

1. 미처리 Mycobacterium tuberculosis(Mtb) 세포외 소포체(EV) 농축액 제조

참고: Mtb 배양 및 배양 여과액 단백질(CFP) 준비에 대한 자세한 절차. 박테리아 배양 배지에는 올레산 알부민 포도당 카탈라아제(OADC)와 같은 EV 함유 또는 단백질 성분이 포함된 성장 보충제 및 Tween과 같은 세제가 없는 것이 좋습니다. 또한 박테리아 배양의 품질과 수확된 CFP를 스크리닝하여 세포 사멸 및 용해를 제한하는 것이 좋습니다.

1. 인산염 완충 식염수(1x PBS)의 전체 부피를 추가하여 100kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터(재료 표 참조)를 준비합니다. 4°C에서 2,800 x g에서 5분 동안 원심분리기.
   알림:데드 스톱 볼륨이 없는 필터를 사용하는 경우 s를 확인해야 합니다.ample 볼륨이 필터 수준 이하로 감소하여 원심분리 중에 필터가 완전히 건조되지 않도록 합니다.
2. 시료 챔버에 Mtb CFP를 최대 용량까지 채우기 전에 관류와 남은 PBS를 폐기하십시오. 부피가 한외여과 장치의 최소 부피로 감소할 때까지 4°C에서 2,800 x g에서 원심분리기. 필요에 따라 반복하여 전체 샘플이 충분히 감소할 때까지 장치에 CFP를 더 추가합니다.
   메모: 원하는 경우 다운스트림 적격성 평가를 위해 100kDa 플로우스루(100F) 재료의 일부를 유지합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
3. 농축액이 포함된 필터 장치에 총 장치 용량까지 1x PBS를 추가합니다. 1.2에 설명된 대로 볼륨을 줄입니다. 이 단계를 5회 반복하여 완전한 세척 및 완충액 교환을 보장합니다.
4. 한외여과 장치 사양에 따라 100kDa 농축 CFP 잔류물(100R)을 회수합니다(재료 표 참조). 100R이 회수되면 최소 부피인 1x PBS로 필터를 최소 3회 세척하고 100R로 세척을 풀링하여 회수율을 최대화합니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 BCA(bicinchoninic assay)로 100R 물질을 정량화합니다(재료 표 참조). 분석을 수행하려면 PBS에서 샘플 1:2, 1:5 및 1:10을 여러 번 희석합니다. triplicate.
   에서 샘플을 테스트합니다. 메모: 원하는 경우 다운스트림 적격성 평가를 위해 100R 재료의 일부를 보존합니다. 4 °C에서 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자동 분획 분취기(Automatic Fraction Collector	아이존 사이언스	AFC-V1-미국 달러
Centricon Plus - 70 원심분리 필터, 100 kDa 컷오프	밀리포어 시그마	UFC710008	1.1단계에서 사용된 한외여과 장치
인산염 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 없는 1X	코 닝	21-040-이력서
니트로셀룰로오스 멤브레인, 롤, 0.2 μm	바이오라드	1620112

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