1. Mtb EV 원유 농축액 제조
참고: Mtb 배양 및 배양 여과액 단백질(CFP) 준비에 대한 자세한 절차는 참고 문헌을 참조하십시오. 박테리아 배양 배지에는 올레산 알부민 포도당 카탈라아제(OADC)와 같은 EV 함유 또는 단백질 성분이 포함된 성장 보충제 및 Tween과 같은 세제가 없는 것이 좋습니다. 또한 박테리아 배양의 품질과 수확된 CFP를 스크리닝하여 세포 사멸 및 용해를 제한하는 것이 좋습니다.
- 인산염 완충 식염수(1x PBS)의 전체 부피를 추가하여 100kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터(재료 표 참조)를 준비합니다. 4°C에서 2,800 x g에서 5분 동안 원심분리기.
메모: 데드 스톱 부피가 없는 필터를 사용하는 경우, 시료 부피가 필터 수준 이하로 감소하여 원심분리 중에 필터가 완전히 건조되지 않도록 주의해야 합니다.
- 시료 챔버에 Mtb CFP를 최대 용량까지 채우기 전에 관류와 남은 PBS를 폐기하십시오. 부피가 한외여과 장치의 최소 부피로 감소할 때까지 4°C에서 2,800 x g에서 원심분리기. 필요에 따라 반복하여 전체 샘플이 충분히 감소할 때까지 장치에 CFP를 더 추가합니다.
메모: 원하는 경우 다운스트림 적격성 평가를 위해 100kDa 플로우스루(100F) 재료의 일부를 유지합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 농축액이 포함된 필터 장치에 총 장치 용량까지 1x PBS를 추가합니다. 1.2에 설명된 대로 볼륨을 줄입니다. 이 단계를 5회 반복하여 완전한 세척 및 완충액 교환을 보장합니다.
- 한외여과 장치 사양에 따라 100kDa 농축 CFP 잔류물(100R)을 회수합니다(재료 표 참조). 100R이 회수되면 최소 부피인 1x PBS로 필터를 최소 3회 세척하고 100R로 세척을 풀링하여 회수율을 최대화합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 BCA(bicinchoninic assay)로 100R 물질을 정량화합니다(재료 표 참조). 분석을 수행하려면 PBS에서 샘플 1:2, 1:5 및 1:10을 여러 번 희석합니다. triplicate.
에서 샘플을 테스트합니다.
메모: 원하는 경우 다운스트림 적격성 평가를 위해 100R 재료의 일부를 보존합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. CFP의 Mtb EV 농축을 위한 크기 배제 크로마토그래
피
참고: 다음 절차는 SEC 컬럼 및 자동 분획 분취기(AFC, 재료 표 참조)와 함께 3mg의 100R Mtb CFP를 사용하는 경우에만 적용됩니다. 다른 시작 농도 및 컬럼 유형에 맞게 제조업체의 사양에 따라 조정할 수 있습니다. 또한 사용자는 자동 분획 분취기 사용 설명서를 읽고 이해하는 것이 좋습니다.
- SEC 컬럼이 실온과 평형을 이루도록 합니다.
- 타워 장치 뒷면에 있는 전원 스위치를 사용하여 AFC를 켜고 필요한 경우 메인 메뉴 터치스크린에서 SETUP을 눌러 로드 셀에 대한 설정을 조정합니다. 로드 셀은 처음 사용할 때, 모든 소프트웨어 업데이트 후, 그리고 분획 분취 부피의 불일치가 발견되는 경우에만 교정해야 합니다.
- SETUP 화면에서 CAROUSEL > CALIBRATE를 선택하여 캐러셀을 정렬합니다. 13개의 작은 구멍이 AFC 타워를 향하도록 캐러셀을 삽입하고 - 및/또는 + 버튼을 눌러 유체 노즐이 플러시 위치 바로 위에 있도록 캐러셀을 조정합니다.
- 평형을 이룬 SEC 컬럼에서 캡을 제거합니다. SEC 컬럼을 해당 컬럼 마운트에 밀어 넣고 AFC 타워에 조심스럽게 설치합니다. 컬럼의 RFID(Radio Frequency Identification) 태그가 AFC를 향하고 컬럼과 밸브 사이의 연결이 안전한지 확인합니다. 폐기물 배출 튜브를 수거 용기에 넣습니다.
- SETUP 화면에서 Collection Schedule을 선택하고 - 및/또는 + 버튼을 눌러 개수를 13으로, 크기를 0.5mL로 설정합니다. "Buffer Volume(버퍼 용량)" 설정을 기본값인 2.7mL로 그대로 두고 X를 눌러 "Collection Schedule(수집 일정)" 창을 닫습니다.
- 홈 화면에서 START COLLECTION(수집 시작)을 선택하고 YES(예)를 선택하여 수집 매개변수를 확인합니다. 라벨이 붙은 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브 13개를 뚜껑을 열고 캐러셀 중앙을 향하도록 로드합니다.
- OK를 선택하여 AFC를 전진시킨 다음 컬럼 저장소를 장착하고 OK를 눌러 다시 전진합니다. YES를 눌러 컬럼을 플러시하는 옵션을 선택하고 0.2μm 필터링된 PBS의 컬럼 부피 하나를 추가하여 스토리지 버퍼를 제거합니다. 플러시가 완료되면 OK를 눌러 AFC를 진행합니다.
- 캐러셀 커버를 AFC 위에 놓고 OK를 누릅니다. 0.2μm 여과된 PBS의 컬럼 부피 1개를 준비합니다. 피펫을 사용하여 컬럼에서 초과 버퍼를 제거합니다.
- 1.5단계에서 정량화된 100R 시료 3mg을 1x PBS를 사용하여 500μL로 가져옵니다. 3mg 샘플을 컬럼 상단에 추가합니다. AFC를 전진시키고 샘플이 프릿으로 흘러 들어가도록 합니다. 샘플이 컬럼에 완전히 입력되면 2.6단계에서 준비한 PBS를 저장소에 추가합니다.
- AFC가 먼저 공극 부피를 수집한 다음 지정된 분획을 수집하는 동안 AFC의 실행을 모니터링합니다. 실행이 완료되고 캐러셀이 폐기물 위치로 돌아간 후 커버를 제거하고 캐러셀에서 분획 튜브를 제거합니다. 정량화(3단계) 및 적격성평가(4단계) 전에 분획을 4°C에서 보관하십시오.
- 열을 재사용하려면 YES를 눌러 열을 청소하는 옵션을 선택하고, 그렇지 않으면 NO를 누릅니다. AFC.
의 지침을 따릅니다.
참고: 컬럼이 세척되고 저장 버퍼가 통과하면 제거하고 캡을 씌운 다음 4°C에서 보관할 수 있습니다.