진균 병원체에 감염된 제브라피시 유충을 시각화하기 위한 zWEDGI 기법

초록

출처: Thrikawala, S. et al., 숙주-병원체 상호작용 분석을 위한 아스페르길루스 포자를 이용한 제브라피시 유충 감염.J. Vis. 특급(2020년)

이 비디오는 제브라피시 유충에서 형광 표지된 곰팡이 병원체 감염을 관찰하기 위한 제브라피시 상처 및 포획 장치 기술을 보여줍니다. 초기 감염은 대식세포를 끌어들이고, 감염이 지속됨에 따라 주사 부위에서 호중구 동원이 진행됩니다.

프로토콜

1. 주입을위한 Aspergillus 포자의 준비

1. Aspergillus 포자 현탁액에서 1 x 10⁶ 포자를 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다. 부피는 20–100 μL여야 합니다. 그렇지 않은 경우 0.01%(v/v) 멸균 Tween-20(Tween-water; 재료 표). 예를 들어, 계산된 부피가 5μL인 경우 10배 희석을 생성하고 50μL의 희석된 용액을 사용합니다.
   메모: 더 많은 포자를 수집하거나 오염의 경우 예비로 사용하기 위해 두 개의 플레이트/균주를 준비할 수 있습니다.
2. 생물 안전 캐비닛에 멸균 일회용 L자형 스프레더를 사용하여 하나의 포도당 최소 매체(GMM) 플레이트(재료 표)에 1 x 10⁶ 아스페르길루스 포자를 펴 바릅니다. 접시 가장자리로 퍼지지 마십시오. 37 ° C에서 3-4 일 동안 접시가 거꾸로 향하게하여 배양합니다.
3. 채취 당일에는 멸균 miracloth와 50mL 원뿔형 튜브(균주당 2개), 새 멸균 트윈 워터 병(균주당 1개) 및 멸균 일회용 L자형 스프레더를 생물 안전 캐비닛에 가져옵니다.
   메모: Miracloth는 ~8인치 x 6개 조각으로 자르고 호일로 싸서 고압멸균할 수 있습니다.
4. 라벨이 붙은 각 50mL 원뿔형 튜브에 miracloth 한 조각을 놓고 뚜껑을 다시 닫습니다. 후드에서 나머지 miracloth 패킷을 꺼냅니다.
5. 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 접시 하나를 연 다음 접시의 약 4분의 3을 덮을 수 있도록 상단에 트윈 물을 붓습니다.
6. 일회용 L자형 스프레더를 사용하여 곰팡이 배양 표면을 앞뒤로 부드럽게 긁어내고 다른 손으로 플레이트를 회전시킵니다. 거의 모든 포자가 트윈 물로 균질화될 때까지 긁어냅니다.
   메모: 높은 소수성으로 인해 포자는 트윈 물을 추가하거나 긁는 동안 "퍼프"를 생성할 수 있습니다. 근처의 튜브나 플레이트가 오염되지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 장갑을 교체하고 다른 균주를 추출하는 사이에 70 % 에탄올로 표면을 닦아내는 것이 좋습니다.
7. 50mL 원뿔형 튜브 1개를 가져다가 미라클로스 조각을 제거합니다. 반으로 접어 50mL 원추형 튜브 상단에 삽입된 필터에 넣습니다.
8. 플레이트의 곰팡이 균질액을 miracloth 위에 튜브에 붓습니다.
   메모: 한 균주의 두 플레이트가 준비되면 두 플레이트를 모두 긁어 동일한 원추형 튜브에 붓습니다.
9. Tween 물을 부어 원뿔형 튜브의 총 부피를 50mL로 만듭니다.
10. 900 x g에서 10분 동안 회전합니다.원심분리기에 에어로졸화 방지 캡을 사용하십시오.
11. 오염을 제거하기 위해 상등액을 ~10% 표백제 용액에 붓습니다. 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL를 원뿔형 튜브에 붓고 와류 또는 흔들어 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
12. 900 x g에서 10분 동안 다시 회전합니다. 상층액을 붓고 펠릿을 5mL의 멸균 1x PBS에 재현탁합니다. 새 miracloth 조각을 새 50mL 원뿔형 튜브에 여과합니다.
13. 1.7mL 원심분리 튜브에서 곰팡이 균질액을 10배 연속 희석(10x, 100x, 1000x)합니다(예: 10x 용액의 경우 100μL의 곰팡이 균질액과 900μL의 Tween-water를 혼합).
14. Tween-water로 배출될 때 포자가 보이지 않는 첫 번째 희석액을 선택하고 이 희석액을 사용하여 혈구계를 사용하여 포자 수를 계산합니다.
15. 다음 공식을 사용하여 준비된 곰팡이 균질산염(수분 현탁액)의 포자 농도를 계산합니다
    농도(포자/mL) = 중간의 포자 수 25 상자 x 희석 계수 x 10⁴
16. 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브의 멸균 1x PBS에 1.5 x 10⁸ 포자/mL의 1mL 스톡을 준비합니다. 이 포자 제제는 4 °C에서 ~ 4 주 동안 보관할 수 있습니다.
17. 주사에 사용하기 전에 1.7mL 원심분리 튜브에서 20μL의 포자 제제와 10μL의 1% 멸균 페놀 레드를 혼합하여 1 x 10⁸ 포자/mL의 최종 포자 농도를 달성합니다. 주입하기 전에 철저히 와류를 치십시오.
    참고: 1% 페놀 레드 용액은 필터 멸균하여 부분 표본에 보관해야 합니다.
18. 모의 주사의 경우 20μL의 1x PBS와 10μL의 1% 멸균 페놀 레드를 혼합합니다.

2. 주입을위한 한천 플레이트의 준비

1. E3 배지에 2% 아가로스를 준비하고 전자레인지에 녹입니다.
2. 100mm x 15mm 페트리 접시(접시당 ~25mL)에 붓고 접시를 고르게 덮도록 휘젓고 식힙니다.
3. 플레이트를 파라핀 필름으로 감싸고 4 °C에서 거꾸로 보관하십시오.
4. 주입하기 전에 플레이트를 실온(RT)으로 가져옵니다.
5. 필터 멸균된 1% 소 혈청 알부민(BSA) ~2mL를 플레이트에 붓고 플레이트를 기울여 바닥 전체를 펴고 덮은 다음 E3.
   로 헹굽니다. 참고: 2% BSA 용액은 필터 멸균 및 -20°C에서 1mL 분취액으로 보관할 수 있습니다. 2% BSA 전처리는 유충이 아가로스 표면에 달라붙는 것을 방지합니다.
6. 버퍼링된 트리카인이 함유된 E3를 플레이트에 붓고 주입할 때까지 그대로 둡니다.

3. 제브라피쉬 유충 뒷뇌실 미세주입

1. 페트리 접시에서 2 dpf에서 집게로 유충을 수동으로 디코리온화합니다.
   메모: Dechorionation은 1.5 dpf부터 주입 시점까지 언제든지 수행 할 수 있습니다.
2. 페트리 접시에서 가능한 한 많은 E3를 제거하고 E3에 완충된 300μg/mL 트리카인을 추가하여 유충을 마취합니다.
   메모: E3에서 완충된 4mg/mL 트리카인의 원액을 준비하고 4°C에서 보관할 수 있습니다. 작업 용액은 4mL의 원액을 최대 50mL까지 E3로 희석하여 만들 수 있습니다.
3. 압력 주입기, 배압 장치, 풋스위치, 마이크로 피펫 홀더, 마이크로 매니퓰레이터, 마그네틱 스탠드 및 플레이트와 함께 제공된 미세 주입 설정을 사용하여 모두 압축 공기 공급원에 연결합니다(재료 표).
4. 압축 공기 밸브를 열고 마이크로인젝터를 켭니다. 압력을 ~25PSI로, 펄스 지속 시간을 60ms로, 배압 단위를 1PSI(제곱인치당 파운드)로 설정합니다.
5. 마이크로로더 피펫 팁(Table of Materials)을 사용하여 약 3–5μL의 준비된 PBS 또는 페놀 레드가 포함된 포자 현탁액을 사용하여 마이크로주입 바늘을 로드합니다. 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다.
   메모: 마이크로 주사 바늘은 앞에서 설명한 대로 준비할 수 있습니다. 미세주입에 사용되는 실체현미경에는 미세주사 바늘을 보정하기 위한 접안렌즈 십자선이 있어야 합니다. 레티클은 스테이지 마이크로미터로 보정해야 하며 레티클 스케일의 길이(μm)를 결정해야 합니다. 바늘에서 분출되는 포자 현탁액 방울의 직경은 방울과 겹치는 해시(십자선)의 수에 따라 측정됩니다.
6. 바늘 끝이 실체 현미경 아래에서 가장 낮은 배율로 보이도록 미세 조작기를 배치합니다. 바늘을 계속 볼 수 있도록 4배 확대/축소합니다.
7. 날카로운 집게를 사용하여 바늘 끝을 자릅니다. 주입 페달을 밟아 나오는 물방울의 크기를 시각화합니다. ~3nL의 포자 현탁액이 주입될 때까지 계속 클리핑합니다(여기서는 5개의 해시입니다).
8. 유충이 주입판에 배열되어 있는 동안 실수로 바늘에 부딪히지 않도록 미세 조작기와 바늘을 치우십시오.
9. 주입판에서 E3-Tricaine을 붓고 전사 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 E3로 ~24마리의 마취된 유충을 주입판으로 옮깁니다.
10. 제브라피시 유충을 조작하기 위한 작은 도구(즉, 헤어 루프 도구 또는 속눈썹 도구)를 사용하여 유충이 향하는 방향에 따라 유충을 배열합니다. 구체적으로 말하자면, 오른쪽을 향하는 모든 것을 한 줄에 배치하고 모두 왼쪽을 향하도록 아래 행에 배치합니다.
    메모: 이 배열은 접시에 액체가 너무 많으면 유충이 제자리에서 "떠다니기" 때문에 어렵습니다. 그러나 액체가 너무 적으면 주사에 시간이 오래 걸리면 유충이 마르거나 마취가 끊어질 수 있으므로 문제가 됩니다. 따라서 전체 미세 주입 과정에서 플레이트에 있는 액체의 양에 세심한 주의를 기울여야 합니다.
11. 현미경 줌을 가장 낮은 배율로 조정합니다. micromanipulator를 다시 가져와 바늘이 시야 중앙에서 ~30°–60° 각도로 유충에 가깝도록 배열합니다.
12. 가장 높은 배율로 확대하고 미세 조정 손잡이를 사용하여 바늘의 위치를 추가로 조정합니다. 유충 옆 플레이트의 액체에 포자 현탁액을 주입하여 바늘에서 ~30-70개의 포자가 나오는지 확인합니다. 필요한 경우 사출 설정의 시간과 압력을 조정합니다.
    메모: 이 검사는 바늘에서 나오는 포자의 수가 시간이 지남에 따라 증가하거나 감소할 수 있으므로 5-6마리의 유충마다 반복해야 합니다.
13. 유충이 바늘을 향하는 행부터 시작하여 바늘이 바로 위에 있고 첫 번째 유충 근처에 위치하도록 플레이트를 이동합니다.
14. 마이크로 매니퓰레이터로 바늘을 움직이고, 귀 소포 주위의 조직을 통해 바늘을 삽입하여 후뇌 심실을 뚫습니다. 바늘의 각도에 따라 유충의 올바른 방향을 얻기 위해 필요에 따라 다른 손으로 플레이트를 움직입니다.
15. 바늘 끝이 후뇌실 중앙에 있는지 육안으로 확인하고, 풋 페달을 밟아 포자를 주입하고, 바늘을 부드럽게 집어넣습니다.
    메모: 페놀 레드 염료는 주로 후뇌 심실 내에 있어야 합니다. 소량이 중뇌로 들어갈 수 있지만 전뇌나 뇌 외부로 도달해서는 안 됩니다. 이 경우 주입되는 부피가 너무 커서 그에 따라 압력과 시간을 줄이거나 새 바늘을 보정해야 합니다.
16. 접시 아래로 이동하여 해당 줄에 있는 모든 유충을 주입합니다. 그런 다음 접시를 뒤집고 모든 유충을 다른 줄에 주입합니다.
    메모: 주입에 실패하거나 실수로 손상된 유충은 1) 노른자에 몇 번 주입하여 빨간색 표시를 만들거나 2) 바늘로 유충을 줄 밖으로 끌어내는 것으로 표시할 수 있습니다.
17. 바늘을 위로 움직여 다시 방해가 되지 않도록 합니다. 현미경에서 더 낮은 배율로 축소합니다. 페놀 레드 염료는 각 유충의 뒷뇌에서 여전히 볼 수 있어야 합니다.
18. 먼저, 헤어 루프 도구와 피펫을 사용하여 주사에 실패한 유충을 처리합니다. 남은 유충을 새 멸균 E3와 이송 피펫으로 플레이트에서 씻어내어 새 페트리 접시로 옮깁니다.
19. 원하는 최종 실험 샘플 번호에 대해 필요에 따라 반복합니다.
20. E3로 유충을 최소 2번 헹구고 마취 후 회복을 확인하십시오.
21. 추가 처리 없이 생존을 정량화하려면 이송 피펫을 사용하여 유충을 E3의 96웰 플레이트(웰당 유충 1개)로 이송합니다.

4. 주입 및 실행 가능한 포자 수 설정

1. 주입 직후 이송 피펫을 사용하여 주입된 유충 중 약 8마리를 무작위로 선택하여 1.7mL 원심분리 튜브(튜브당 유충 1마리)로 옮깁니다.
2. 유충을 트리카인으로 안락사시키거나 4°C에서 0.5-2.0시간 동안 놓아둡니다.
3. 멸균 1x PBS에 1mg/mL 암피실린 및 0.5mg/mL 카나마이신 항생제 용액 1mL를 준비합니다. 남은 용액은 4 °C에서 보관하고 나중에 사용할 수 있습니다.
   메모: 100mg/mL의 암피실린과 50mg/mL의 카나마이신의 원액을 사전 제조하고 필터 멸균하여 -20°C의 분취량에 보관할 수 있습니다. 이 용액을 1x PBS에 100배 희석하여 작업 용액을 얻습니다.
4. 피펫을 사용하여 유충을 남기고 원심분리기 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거하고 항생제가 든 90μL의 1x PBS를 추가합니다.
   메모: 항생제는 Aspergillus 군집의 계수를 방해할 수 있는 GMM 플레이트의 박테리아 성장을 방지하기 위해 사용됩니다.
5. 조직 용해기에서 유충을 1,800 진동/분(30Hz)으로 6분 동안 균질화하고 17,000 x g에서 30초 동안 스핀다운합니다.
6. GMM 플레이트에 라벨을 붙입니다(균질화된 유충당 하나의 플레이트). 분젠 버너를 사용하여 멸균 환경을 조성하고, 한 튜브에서 GMM 플레이트의 중앙까지 균질화된 현탁액을 피펫팅한 다음 일회용 L자형 스프레더를 사용하여 펴 바릅니다. 균질산염을 테두리에 펴지 마십시오.
7. 플레이트를 37 ° C에서 2-3 일 동안 거꾸로 배양하고 형성 된 집락 수, 집락 형성 단위 (CFU)를 계산합니다.
8. 감염 기간 동안 살아있는 포자의 수를 측정하려면 주입 후 1-7일(dpi)에 96웰 플레이트에서 유충을 선택하여 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4.1–4.5단계에서 설명한 대로 유충을 안락사시키고 균질화하여 GMM 플레이트에 퍼집니다.

5. 주입 된 유충의 약물 치료

1. 섹션 4 이후, 주입된 나머지 유충을 두 개의 3.5mm 접시(하나는 약물 치료용, 다른 하나는 대조용)로 나눕니다. 조건당 약 24마리의 감염된 유충을 사용합니다.
   메모: 3.5mm 접시는 물에 2% 무지방 분유로 처리하여 헹구고 자연 건조한 후 미리 RT에서 보관할 수 있습니다. 우유로 코팅하면 유충이 플라스틱에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다.
2. 필요한 최종 농도에 따라 원뿔형 튜브에 메틸렌 블루가 없는 E3에서 원하는 약물 용액과 차량을 준비한 다음 잘 혼합합니다. 예를 들어, 덱사메타손에 노출된 유충의 생존을 모니터링하려면 덱사메타손의 경우 24개의 유충(복제)을 사용하고 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 차량 제어에는 24개의 유충을 사용합니다. 필요한 농도로 약물 용액 5mL를 준비합니다. 여기에서는 0.1% DMSO 5mL와 10μM 덱사메타손을 사용하고, 24마리의 유충/상태를 ~200μL의 비히클/약물 용액/유충으로 옮겼습니다.
3. 전사 피펫으로 한 접시에서 가능한 한 많은 액체를 제거하고 차량 제어 장치가 포함된 미리 혼합된 E3를 추가합니다. 다른 요리에 대한 관심 처리가 포함된 미리 혼합된 E3로 반복합니다.
4. 피펫을 사용하여 유충을 96웰 플레이트(웰당 유충 1개)로 옮깁니다. 차량이나 약물에 노출된 주입된 유충의 생존을 7일 동안 모니터링합니다.
   메모: 이 약물은 감염 당일에만 적용할 수 있으며 전체 실험 동안 유충에 보관하거나 매일 새로 고칠 수 있습니다.

6. 제브라피시 성장 및 이미징을 위한 부상 및 포획 장치(zWEDGI)를 사용하여 감염된 유충의 일일 이미징

1. 색소 침착을 방지하기 위해 유충에 24hpf에서 100μM N-phenylthiourea(PTU)를 처리하고 전체 실험 동안 유충에 PTU를 유지해야 합니다.
   메모: 75–100 μM의 PTU는 심각한 발달 결함 없이 유충의 색소 침착을 방지합니다. 그러나 PTU는 일부 생물학적 과정을 방해할 수 있으며 연구자들은 약물이 연구 중인 과정에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 미리 결정해야 합니다.
2. 섹션 3에 설명된 대로 형광 단백질을 발현하도록 조작된 Aspergillus 포자로 2 dpf에서 라벨링된 관심 세포 집단으로 형질전환 유충을 감염시킵니다. 그런 다음 감염된 유충을 메틸렌 블루가 없는 약 500μL/웰의 E3에 있는 48웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
   메모: 여기에 48웰 플레이트가 사용되는데, 이는 매일 반복되는 이미징 중에 유충을 안팎으로 옮기는 것이 더 쉽기 때문입니다.
3. 이미징 당일에는 3.5mm 페트리 접시 2개(100μM PTU와 E3-트리카인이 있는 접시)를 준비합니다.
4. E3-트리카인을 zWEDGI 장치의 챔버에 추가합니다. 실체 현미경 아래에서 P100 마이크로피펫을 사용하여 챔버와 구속 채널의 기포를 제거합니다. 여분의 E3-트리카인을 모두 제거하여 챔버에만 있도록 합니다.
5. 이송 피펫을 사용하여 플레이트에서 유충 한 마리를 피펫으로 올립니다. 많은 양의 액체를 사용하여 제거하는 경우 E3.5-PTU가 들어 있는 3mm 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 가능한 한 적은 액체를 사용하여 다시 피펫을 만들고 E3-트리카인으로 옮깁니다.
6. 마취를 위해 ~30초 동안 기다린 다음 부상 및 포착 장치(예: zWEDGI)의 장전실로 옮깁니다.
7. 실체 현미경 아래에 유충을 배치합니다. P100 마이크로피펫을 사용하여 상처 챔버에서 E3-트리카인을 제거하고 로딩 챔버로 방출하여 유충의 꼬리를 제한 채널로 이동합니다. 유충이 측면, 등쪽 또는 배측 측면에 위치하여 거꾸로 된 대물렌즈로 뒷뇌를 이미지화할 수 있도록 합니다.
8. 컨포칼 현미경을 사용한 이미지 유충.
9. 이미징 후 P100 피펫을 사용하여 E3-tricaine을 상처 챔버로 방출하여 유충을 구속 채널에서 로딩 챔버로 밀어 넣습니다.
10. 전사 피펫을 사용하여 유충을 집어 E3-Tricaine이 함유된 페트리 접시로 다시 옮깁니다. 가능한 한 적은 액체를 사용하여 E3-PTU를 사용하여 페트리 접시로 옮깁니다. PTU로 헹구고 48웰 플레이트로 다시 옮깁니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뒤몽 겸자 #5	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5045
접안렌즈 레티클	현미경 세계	레트르10	바늘 교정용, 실체현미경에 사용
마이크로인젝터 설정: 배압 장치	응용 과학 계측	비푸
풋스위치	응용 과학 계측	증권 시세
마이크로 피펫 홀더 키트	응용 과학 계측	M-핍
압력 인젝터	응용 과학 계측	MPPI-3
Micromanipulator 설정: Micromanipulator	나라시게(트라이텍)	엠-152
마그네틱 스탠드 및 플레이트	(주)트라이텍	민제이-HBMB
니들 풀러	셔터 계기	P-97
실체현미경	니콘	SMZ-745
티슈라이저 II	키아겐	85300	유충을 균질화하기 위해
재료
아가로스	어부	BP160-500
암피실린 나트륨 염	어부	AAJ6380706
BSA, 분수 V	폭스바겐	AAJ65855-22
카나마이신 설페이트	어부	AAJ1792406
L 스프레더	어부	전화: 14호 665 230
미세 모세관 바늘(필라멘트 없음)	세계 정밀 기기(WPI)	TW100-3
Microloader 피펫 팁	폭스바겐	89009-310	Aspergillus 현탁액으로 바늘을 로드하려면
미라클로스	폭스바겐	EM475855-1R	Aspergillus 현탁액을 필터링하려면
N-페닐티오우레아	어부	AAL0669009	색소 침착을 방지하기 위해
페놀 레드, 1% 용액	어부	57254
트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트, 메탄설폰산염)	어부	AC118000500	유충을 마취하기 위해
트윈-20	어부	BP337-500
미디어 및 솔루션			구성 요소/레시피
E3 미디어: 60x E3			17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 ·7H2O, H2O와 함께 1 L까지
E3 1개			16.7ml 60x 스톡, 430ul 0.05M NaOH, H2O 포함 1L(옵션: + 3ml 0.01% 메틸렌 블루)
트리카인 원액			트리카인 2g, Na2HPO4 5g · 7H2O, 4.2ml 60X E3, H2O의 경우 500ml, NaOH의 경우 pH 7.0-7.5
포도당 최소 매체(GMM) 한천: GMM 한천			포도당 10g(포도당), 50ml 20x 질산염, 1ml TE, H2O로 1L, NaOH로 pH 6.5, + 16g 한천, 오토클레이브
20x 질산염			120g NaNO3, 10.4g KCl, 10.4g, MgSO4 · 7H2O, 30.4g, KH2PO4, H2O가 있는 1L까지, 오토클레이브
미량 원소(TE)			2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, H2O와 100 ml에, 밤새 교반, 오토 클레이브

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