곤충 번데기의 염증 세포 역학을 탐구하기 위한 광변환 기술

Abstract

출처: Weavers, H. et al., Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 번데기의 염증 세포 역학을 연구하기 위해 광 변환을 사용하는 방법을 보여줍니다. 녹색 적혈구는 상처 입은 상피로 끌려가고, 그 다음에는 먼 곳으로 이동한다. 광변환은 특정 혈구를 녹색에서 빨간색으로 이동시켜 움직임을 쉽게 추적할 수 있도록 합니다.

Protocol

이 프로토콜은 (1) 초파리 스톡의 준비 및 번데기의 병기, (2) 번데기 해 부 및 장착, (3) 번데기 상처, (4) 생체 내 타임랩스 컨포칼 이미징의 네 가지 주요 순차적 단계로 구성됩니다.

1. 번데기의 준비 및 준비

1. 적절한 초파리 재고를 확보합니다(소개 및 재료표 참조).
2. 적절한 유전자형의 젊고 건강한 성충 파리를 수집합니다.
   1. 이산화탄소 가스 패드를 사용하여 파리를 잠시 마취하고 미세한 붓을 사용하여 적절한 유전자형 또는 성별의 파리를 수집 바이알에 옮겨 성충 파리를 선택합니다.
   2. 효모가 보충된 표준 플라이 푸드 배지(옥수수 가루-당밀-한천 혼합물, 재료 표 참조)가 들어 있는 각 바이알에 20마리의 처녀 암컷과 20마리의 수컷을 추가합니다.
3. 최적의 번데기 생성을 위해 모든 바이알을 25°C로 유지하고 매일 성충 파리를 신선한 바이알에 담긴 새로운 음식에 먹이십시오.
   메모: Gal4-upstream activating sequence(Gal4-UAS) 시스템을 사용하여 계통 특이적 유전자 발현을 유도하는 경우 Gal4-UAS 시스템은 온도에 민감하므로 모든 단계를 25°C 이상에서 수행해야 합니다.
4. 예정된 이미징 세션 18시간 전에 집게 또는 고운 붓을 사용하여 바이알에서 새로 형성된 흰색 번데기(그림 1A) 10개 이상(즉, 번데기 형성 후 0시간, APF)을 선택하여 내부 바이알 표면에서 번데기를 제거하고 번데기를 깨끗하고 빈 플라스틱 바이알 측면으로 조심스럽게 옮깁니다.
   메모: 방황하는 3^번째 instar 유충은 번데기를 겪기 위해 먹이 매체에서 위쪽으로 기어 올라갑니다. 새로 형성된 white prepupae는 앞쪽 첨탑을 가지고 있고 고정되어 있기 때문에 쉽게 식별됩니다(^3rd instar 유충과 달리). 큐티클은 처음에는 부드럽고 흰색인 '번데기'(번데기)로 변형됩니다. 번데기가 손상되지 않도록 주의해야 하며, 이는 원치 않는 부상으로 인한 염증 반응뿐만 아니라 심각한 발달 지연으로 이어질 수 있으므로 주의를 기울여야 합니다.
5. 선택한 번데기를 25°C의 바이알에서 적절한 발달 단계(18시간 APF가 최적의 결과를 제공함)로 숙성시킵니다.
   메모: 번데기가 발달함에 따라 번데기는 점점 더 어둡고 부서지기 쉬워집니다.
6. 다음 단계를 위해 다른 시약을 미리 준비하십시오. 헵탄 접착제를 만들려면 50mL 원심분리 튜브에 20cm 길이의 롤업 양면 테이프와 20mL 헵탄을 결합하고 파라핀 필름으로 밀봉한 다음 벤치에서 하룻밤 동안 실온에서 흔들어 둡니다.

2. Drosophila Pupae의 준비 및 해부

1. 준비된 초파리 번데기를 유리 슬라이드에 장착된 양면 접착 테이프 조각으로 옮깁니다. 배쪽 쪽이 테이프에 단단히 붙고 등쪽 쪽이 위쪽을 향하도록 번데기를 배치합니다(그림 1B).
   메모: 번데기의 앞쪽은 번데기의 앞쪽 끝에서 돌출된 두 개의 첨탑으로 식별할 수 있습니다.
2. 집게와 마이크로 가위를 사용하여 명시야 해부 현미경 아래의 보호용 번데기 케이스에서 번데기를 조심스럽게 꺼냅니다(그림 1B-D).
   1. 처음에는 집게를 사용하여 번데기의 가장 앞쪽 부분을 절개합니다(그림 1B). 이 부위의 번데기 케이스가 비어 있고 번데기 조직이 없는지 확인하십시오. 번데기는 초기 번데기 발달 중에 케이스 내에서 줄어들 것이기 때문입니다.
   2. 이 초기 절개 후 번데기가 갈색의 불투명한 부서지기 쉬운 케이싱(그림 1D)에서 완전히 자유로워질 때까지 집게나 마이크로 가위(그림 1C)를 사용하여 번데기 케이스를 전후 방향으로 조심스럽게 찢거나 잘라냅니다(그림 1C).
      메모: 이 단계의 번데기는 매우 연약하므로 번데기 표면에 구멍이 나지 않도록 주의해야 합니다. 천자 부위에서 혈림프가 빠르게 누출되기 때문에 천공이 분명합니다. 구멍이 난 번데기는 아무리 작더라도 버려야 합니다.
3. 헵탄 접착제를 사용하여 바닥이 유리로 된 접시에 번데기를 장착합니다.
   1. 20mL 피펫 팁을 사용하여 미리 준비된 헵탄 접착제 10mL 방울(위의 섹션 1.6 참조)을 유리 바닥 접시에 일렬로 놓습니다.
   2. 집게를 사용하여 절개된 번데기를 헵탄 접착제에 조심스럽게 옮기기 전에 접착제를 5초 동안 건조시킵니다(그림 1E).
   3. 상처를 쉽게 입히고 영상을 촬영하기 위해, 번데기를 일렬로 세우십시오. 약 5마리의 번데기가 제안되지만 경험이 쌓이면 더 많이 관리할 수 있습니다.
      메모: 헵탄 접착제의 사용은 정립 이미징 시스템을 사용할 때 권장되지만 반전 시스템을 사용할 때는 필요하지 않습니다. 이미징 중에 접착제가 광학 수차를 생성하는 경우, 번데기를 커버 유리에 직접 놓을 수 있습니다 – 번데기 조직과 유리 사이의 자연스러운 접착력은 현미경 간에 이미징 접시를 이동할 때 주의를 기울이는 한 대부분의 경우 안정적인 이미징을 위해 충분할 것입니다.
4. 최상의 결과를 얻으려면 날개 표면의 대부분이 커버 유리와 직접 접촉하도록 날개가 커버 유리에 평평하게 장착되도록 번데기를 장착하십시오(그림 1F). 날개가 올바르게 장착되었는지 확인하기 위해 집게를 사용하여 번데기를 굴려 위치를 변경합니다.
5. 이미징 기간 동안 샘플 탈수를 방지하려면 번데기를 방해하지 않도록 주의하면서 장착이 끝날 때 유리 바닥 접시 측면에 증류수에 적신 흡수성 여과지 조각을 추가합니다(그림 1E). 접시를 뚜껑으로 덮습니다.
   메모: 번데기는 이제 상처를 입히고 이미징할 준비가 되었습니다.

3. 초파리 번데기 날개의 레이저 유발 상처

1. 장착된 번데기가 들어 있는 유리 바닥 접시를 조정 가능한 레이저 절제 시스템이 장착된 광시야 현미경으로 옮깁니다.
   1. 435 nm로 조정된 pulsed-UV 공랭식 질소 펌핑 절제 레이저를 사용하십시오 – 자세한 내용은 재료 표 참조; 조명에 사용되는 빛의 정확한 파장은 적절한 염료 셀을 통해 사용자가 선택합니다.
2. 명시야 광학 장치를 사용하여 현미경 스테이지 컨트롤을 조정하여 상처를 입은 첫 번째 번데기의 번데기 날개를 찾습니다(그림 1F).
3. 최적의 결과를 얻으려면 이미징 및 레이저 절제 모두에 오일 이멀젼 40X 또는 63X 대물 렌즈를 사용하십시오. 사용된 이멀젼 액체(오일 또는 글리세롤)가 어블레이션과 이미징 시스템 간에 일관성이 있는지 확인하십시오. 미세 초점 조절 손잡이를 사용하여 유리 커버슬립에서 가장 가까운 번데기 날개 상피의 평면에 초점을 맞추도록 현미경을 조정합니다(즉, 상처를 입을 상피 영역에 초점).
4. 현미경 스테이지 조정을 사용하여 상처를 입을 영역이 절제 레이저의 알려진 대상 영역과 직접 정렬되도록 번데기 날개를 배치합니다.
5. 현미경에 장착된 에너지 밀도 감쇠기 슬라이드를 사용하여 절제 광의 출력 수준을 수동으로 조정합니다.
   메모: 감쇠기 슬라이더에는 감쇠의 상대적 수준을 식별하고 재현 가능한 설정을 사용할 수 있도록 하는 클릭 정지 및 규칙이 있습니다.
6. 외부 수동 트리거 컨트롤을 사용하여 방아쇠를 한 번 짧게 클릭하여 절제 레이저를 활성화하여 상처를 만듭니다. 절제 부위에 일시적인 기포가 나타나는지 확인하면 상처는 일반적으로 동반되므로 확인하십시오. 번데기 상피를 시각화하기 위해 적절한 형광 필터를 사용하여 레이저로 인한 상처가 성공적으로 이루어졌는지 확인하십시오.
   메모: 빔 반사로 인해 심각한 눈이나 피부가 손상될 수 있으므로 레이저 빔에 우발적으로 노출되지 않도록 주의하십시오.
7. 상처를 입히지 못하면 초점면을 변경하고(현재 초점 수준보다 약간 위 또는 아래로 현미경 초점을 이동) 절제 트리거를 한 번 클릭하는 것을 반복합니다. 또는 원하는 상처 크기에 도달할 때까지 감쇠기 슬라이드를 사용하여 레이저 출력을 점진적으로 증가시킵니다.
8. 절제 레이저 펄스 반복률을 변경하려면 후면 제어판의 반복률 노브를 사용하십시오(1pulse/s 미만에서 최대 60Hz까지 속도 변경). 최적의 상처를 위해 펄스 반복률을 40Hz로 설정하십시오.
9. 다양한 크기의 상처를 생성하려면 에너지 밀도 감쇠기 슬라이드를 사용하여 절제 조명의 출력 수준을 수동으로 조정하십시오.
10. 장착된 모든 번데기에 상처를 입히지 말고 이 절제되지 않은 번데기를 상처 입지 않은 대조군으로 사용하십시오.
11. 일관된 결과를 얻으려면 절제 시스템을 정기적으로 재정렬하십시오(관련 사용 설명서 사용). 또한 레이저 출력 파장을 제어하는 염료 공진기 셀을 청소하고 다시 채웁니다.

4. 생체 내 타임랩스 컨포칼 이미징

1. 저속 촬영을 위해 바닥이 유리로 된 접시를 적절한 현미경으로 빠르게 옮깁니다.
   메모: 최적의 결과를 얻으려면 녹색 형광 단백질(GFP)과 mCherry 형광단을 모두 검출할 수 있는 고감도 검출기가 장착된 고사양 컨포칼 또는 회전 디스크 현미경을 사용하십시오.
2. 번데기 날개 전체를 이미지화하려면 저배율(예: 20X) 대물 렌즈를 사용하십시오(그림 2A). 높은 공간 해상도로 상처 치료와 그에 수반되는 염증 반응을 이미지화하려면 오일 이멀젼 40X(NA 1.3) 또는 63X(NA 1.4) 대물 렌즈를 사용하십시오(그림 2B-D의 대표 이미지 참조).
3. 현미경과 연결된 적절한 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.
4. 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 적절한 레이저(예: 488nm 및 561nm 레이저)를 켜서 각각 GFP 및 mCherry 형광단을 시각화하고(관련 상자를 클릭하여) 픽셀 포화를 피하면서 충분한 형광 신호를 제공하도록 레이저 출력 및 게인/오프셋 설정을 조정합니다. 광표백 및 광독성을 최소화하기 위해 가능한 가장 낮은 레이저 출력(5 - 20% 범위)을 사용합니다.
5. 복구 상피와 염증성 세포 동원을 모두 캡처하려면 제어판의 미세 초점 조정 노브를 사용하여 현미경을 Z 스택을 기록하도록 설정합니다. 최적의 결과를 얻으려면 소프트웨어를 설정하여 번데기 날개(최소 3mm마다)를 통해 상처 입은 상피 상단에서 아래의 세포 외 공간(이동하는 혈구 포함)까지 Z 슬라이스를 기록하여 큰 z-스택(50 - 100 범위)을 달성합니다. mm)을 사용합니다.
6. 타임랩스 이미징의 경우, 상처 후 최소 1시간 동안 일정한 시간 간격(최소 30초마다)으로 z-스택을 기록합니다.
   메모: 선택한 z-스택 간의 정확한 시간 간격은 빠르게 변화하는 세포 역학을 포착하는 것과 샘플의 광표백을 방지하는 것 사이의 절충안을 나타냅니다.
7. 여러 번데기(절제되지 않은 상처 입지 않은 대조군 포함)를 동시에 이미징하려면 전동 스테이지(현미경에 부착됨)와 이미징 소프트웨어 내에서 사용할 수 있는 다중 위치 획득 기능을 사용합니다. 스테이지 위치 컨트롤 노브를 사용하여 소프트웨어 내에서 각 번데기의 위치를 수동으로 설정한 다음 각 번데기에 대해 적절한 z-stack 제한(상단 및 하단)을 수동으로 설정합니다.
8. z-stack 프로젝션 또는 3D 렌더링을 사용하여 이미지 캡처 중 또는 나중에 전문 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 타임랩스 이미지를 시각화합니다. 예를 들어, 개별 혈구의 움직임을 추적하려면(그림 2C' 및 D'와 같이) 오픈 액세스 ImageJ 플러그인 "TrackMate" 또는 "Manual Tracking"(에 발표된 방법)을 사용하여 혈구 핵을 추적합니다.
9. 광변환 프로브(예: Kaede)를 사용하여 이미징 중에 상피 또는 면역 세포의 하위 집합을 선택적으로 광변환하고 레이블을 지정할 수 있습니다.
   1. 이미징 소프트웨어 내에서 적절한 모듈을 열어 광 변환(예: 광표백 후 형광 복구(FRAP) 및 광표백 후 형광 회수 모듈)을 수행하고 405nm 레이저를 활성화합니다(관련 소프트웨어 상자 클릭).
   2. FRAP 소프트웨어 내에서 정사각형, 원형 또는 자유형 선택 도구를 사용하여 사진 변환할 셀을 선택합니다. FRAP 소프트웨어 내에서 광 변환(표백)을 위한 시간 과정을 단일 반복/프레임으로 설정하고 405nm 레이저를 20% 레이저 출력으로 설정합니다. 수동으로 실험 시작을 클릭하여 사진 변환을 수행합니다.
   3. FRAP 모듈을 종료하고(닫기 클릭) 소프트웨어 내의 원래 이미징 화면으로 돌아갑니다. 488nm 및 561nm 레이저를 사용하여 위와 같이 z-stack 및 time-lapse recording을 설정하여 광변환 및 비광변환 셀의 동작을 이미지화합니다.
      메모: 광변환된 프로브는 초기 광변환 후 몇 시간 동안 안정적으로 유지되므로 시간이 지남에 따라(최소 5시간 동안) 광변환된 셀의 동작을 추적할 수 있습니다. 예를 들어, 상처의 염증 세포는 선택적으로 광변환될 수 있으며(그림 2F) 부상 부위에서 분해될 때 염증 세포의 행동을 따를 수 있습니다(그림 2G 및 H).

Results

그림 1: 상처 및 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupa 준비.(A) 0h APF에서 수집된 Drosophila white prepupae, 앞쪽 끝은 everted breathing appendage(spiracles)로 표시됩니다. (B) 25°C에서 18시간 동안 흰색 0h APF prepupae를 올리면 번데기가 갈색으로 나타납니다. 번데기 케이스의 해부는 가장 앞쪽 영역(화살표)에서 시작해야 하며, 번데기가 이 영역에 없기 때문에 번데기가 있는 첨탑으로 표시되며, 보호 번데기 케이스(C)를 제거하는 데 사용되는 미세한 집게 및/또는 마이크로 가위를 사용해야 합니다. 번데기 날개...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
초파리 주식
유비쿼터스 GFP 태그 E-cadherin; 유비-p63E-shg.GFP; (chrII)	교토 주식 센터, DGRC	#109007	Ubi-p63E promoter sequence는 C-terminal end에 GFP로 태그된 Drosophila E-cadherin(shotgun)의 발현을 유도합니다.
유비쿼터스 GFP 태그 E-cadherin;; 유비-p63E-shg.GFP (III)	블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)	#58742	Ubi-p63E promoter sequence는 C-terminal end에 GFP로 태그된 Drosophila E-cadherin(shotgun)의 발현을 유도합니다.
유비쿼터스 GFP 태그 Moesin P{sGMCA}3.1	블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)	#의 59023	유비쿼터스하게 발현되는 sqh promoter/enhancer는 GFPS65T로 태그된 Moesin 단편(actin binding sequences 포함)의 발현을 유도합니다.
적혈구 특이적 뱀-Gal4 드라이버 ; SRP-갈4;	생성: Katja Bruckner	생성: Katja Bruckner	polyA 꼬리에 융합된 Scer\GAL4의 발현은 초파리 뱀의 상류에서 2개의 게놈 염기서열에 의해 제어됩니다. 참조: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. PDGF/VEGF 수용체는 초파리에서 혈액 세포의 생존을 조절합니다. 개발 셀. 7 (1), 73–84, DOI: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6	블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)	#8545 또는 #8547	UAS 조절 서열은 C-말단 끝에 핵 국소화 신호로 태그된 DsRed.T4 형태의 RFP 발현을 주도합니다.
UAS-세포질GFP ;; P{UAS-GFP. S65T}	블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)	여러 재고 사용 가능(예: #1522)	UAS 조절 서열에 의한 GFP의 S65T 버전의 발현; S65T 변형은 증가된 밝기를 나타냅니다.
UAS-photoconvertible카에데 w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)	#의 26161	Kaede 단백질은 합성 후 밝은 녹색 형광을 방출하지만 자외선 조사시 밝고 안정적인 적색 형광으로 효율적으로 변화합니다.
GFP 태그 스파게티 스쿼시 w1118;; P{sqh-GFP.RLC}	블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)	#57145	C-말단 말단에 T:Avic\GFPS65T 태그로 태그된 sqh 코딩 영역은 천연 sqh 프로모터의 제어하에 발현됩니다.
플라이 푸드 미디어용 재료			플라이 푸드 미디어는 표준 절차에 따라 만들어집니다(Greenspan, R. 1997 참조). Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics(파리 밀기: 초파리 유전학의 이론과 실제). 콜드 스프링 하버 프레스. 1-191쪽)
옥수수	Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)	공급업체에 직접 문의	유기농
콩	Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)	공급업체에 직접 문의	유기농
맥아 추출물	Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)	공급업체에 직접 문의	유기농
당밀	Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)	공급업체에 직접 문의	유기농
Difco 한천	BD 바이오사이언스, 피셔 사이언티픽	재질 보기 DF0142-15-2	플라이 푸드 준비를 위해
프로피온산	시그마	402907	플라이 푸드 준비를 위해
니파겐	시그마	79721	플라이 푸드 준비를 위해
말린 빵 효모	Redstar, Dutscher Scientific, 영국 LTD	Redstar, Dutscher Scientific, 영국 LTD	플라이 푸드 준비를 위해
시료 준비 및 장착
파라필름	시그마	P7793-1개	헵탄 접착제의 준비를 위해
고급 세이블 붓	Daler-Rowney (또는 이에 상응하는 것)	#0 또는 1
집게	Fisher Scientific(또는 Fine Science Tools)	NC9404145	뒤몽 #5
이미징을 위한 유리 바닥 접시	매트텍	P35G-0-10-C	코팅되지 않은 최소 10mm Microwell, 0.085-0.13mm 커버 유리와 함께 35mm 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 더 큰 마이크로웰이 있는 접시를 사용하면 단일 실험에서 더 많은 수의 번데기를 장착하고 이미지화할 수 있습니다.
헵탄	시그마	51730-5ML	헵탄 접착제의 준비를 위해
양면 접착 테이프(예: 스카치)	한천 사이언티픽	아그263	헵탄 접착제의 준비를 위해
50ml 튜브(헵탄 접착제용)	Fisher Scientific의 팔콘 튜브	번호 14-432-22	헵탄 접착제의 준비를 위해
유리 현미경 슬라이드	한천 사이언티픽	AGL4244	Drosophila pupae의 해부용
명시야를 이용한 실체 현미경 해부	Leica (또는 동급)	M50	Drosophila pupae의 해부용
마이크로 가위	존 와이스 국제공항	103123	미니어처 연구 가위 (스트레이트)
레이저 절제 및 이미징
니토겐 절제 레이저	Spectra-Physics (또는 Andor equivalent)	모델: VSL-337ND-S	상처의 경우 광시야 이미징 시스템에 연결해야 합니다
다중 레이저 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)	Leica (또는 동급)	Leica DMi8 도립 형광 현미경(또는 동급)에 부착된 TCS AOBS SP8 또는 SP5-II	이상적으로는 다중 사이트 및 '모자이크' 스캐닝을 위한 전동 스테이지와 '하이브리드' GaAsP 검출기(훨씬 더 높은 감도와 낮은 신호 증폭 제공)를 포함합니다.
환경 챔버	라이프 이미징 서비스(또는 이에 상응하는 서비스)	"현미경 온도 제어 시스템"	이미징 중 온도 제어를 위해 컨포칼 현미경에 부착
이미지 분석 소프트웨어
FRAP 소프트웨어 모듈	Leica (또는 동급)	CLSM FRAP 소프트웨어 모듈	Kaede와 같은 광변환 가능한 형광단의 광변환을 수행하기 위해
ImageJ (이미지 분석 소프트웨어)	미국 국립보건원(NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH 이미지를 ImageJ로: 이미지 분석 25년". 네이처 메소드 9, 671-675, 2012.
ImageJ 플러그인 "수동 추적"	미국 국립보건원(NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ 플러그인 "TrackMate"	이미지J, NIH	https://imagej.net/TrackMate	티네베즈, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: 단일 입자 추적을 위한 개방적이고 확장 가능한 플랫폼.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (고성능 3D 이미징 소프트웨어)	퍼킨 엘머	볼로시티 6.3	이미지 분석용
IMARIS(이미지 분석 소프트웨어)	비트플레인	세포 생물학자를 위한 IMARIS	이미지 분석용