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곤충 번데기의 염증 세포 역학을 탐구하기 위한 광변환 기술

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Weavers, H. et al., Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 데기의 염증 세포 역학을 연구하기 위해 광 변환을 사용하는 방법을 보여줍니다. 녹색 적혈구는 상처 입은 상피로 끌려가고, 그 다음에는 먼 곳으로 이동한다. 광변환은 특정 혈구를 녹색에서 빨간색으로 이동시켜 움직임을 쉽게 추적할 수 있도록 합니다.

Protocol

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 (1) 초파리 스톡의 준비 및 번데기의 병기, (2) 번데기 해 부 및 장착, (3) 번데기 상처, (4) 생체 내 타임랩스 컨포칼 이미징의 네 가지 주요 순차적 단계로 구성됩니다.

1. 데기의 준비 및 준비

  1. 적절한 초파리 재고를 확보합니다(소개 및 재료표 참조).
  2. 적절한 유전자형의 젊고 건강한 성충 파리를 수집합니다.
    1. 이산화탄소 가스 패드를 사용하여 파리를 잠시 마취하고 미세한 붓을 사용하여 적절한 유전자형 또는 성별의 파리를 수집 바이알에 옮겨 성충 파리를 선택합니다.
    2. 효모가 보충된 표준 플라이 푸드 배지(옥수수 가루-당밀-한천 혼합물, 재료 표 참조)가 들어 있는 각 바이알에 20마리의 처녀 암컷과 20마리의 수컷을 추가합니다.
  3. 최적의 번데기 생성을 위해 모든 바이알을 25°C로 유지하고 매일 성충 파리를 신선한 바이알에 담긴 새로운 음식에 먹이십시오.
    메모: Gal4-upstream a....

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Results

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1: 상처 및 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupa 준비.(A) 0h APF에서 수집된 Drosophila white prepupae, 앞쪽 끝은 everted breathing appendage(spiracles)로 표시됩니다. (B) 25°C에서 18시간 동안 흰색 0h APF prepupae를 올리면 번데기가 갈색으로 나타납니다. 번데기 케이스의 해부는 가장 앞쪽 영역(화살표)에서 시작해야 하며, 번데기가 이 영역에 없기 때문에 번데기가 있는 첨탑으로 표시되며, 보호 번데기 케이스(C)를 제거하는 데 사용되는 미세한 집게 및/또는 마이크로 가위를 사용해야 합니다. 번데기 날개.......

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Disclosures

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
초파리 주식
유비쿼터스 GFP 태그 E-cadherin; 유비-p63E-shg.GFP; (chrII)교토 주식 센터, DGRC#109007Ubi-p63E promoter sequence는 C-terminal end에 GFP로 태그된 Drosophila E-cadherin(shotgun)의 발현을 유도합니다.
유비쿼터스 GFP 태그 E-cadherin;; 유비-p63E-shg.GFP (III)블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)#58742Ubi-p63E promoter sequence는 C-terminal end에 GFP로 태그된 Drosophila E-cadherin(shotgun)의 발현을 유도합니다.
유비쿼터스 GFP 태그 Moesin P{sGMCA}3.1블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)#의 59023유비쿼터스하게 발현되는 sqh promoter/enhancer는 GFPS65T로 태그된 Moesin 단편(actin binding sequences 포함)의 발현을 유도합니다.
적혈구 특이적 뱀-Gal4 드라이버 ; SRP-갈4;생성: Katja Bruckner생성: Katja BrucknerpolyA 꼬리에 융합된 Scer\GAL4의 발현은 초파리 뱀의 상류에서 2개의 게놈 염기서열에 의해 제어됩니다. 참조: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. PDGF/VEGF 수용체는 초파리에서 혈액 세포의 생존을 조절합니다. 개발 셀. 7 (1), 73–84, DOI: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)#8545 또는 #8547UAS 조절 서열은 C-말단 끝에 핵 국소화 신호로 태그된 DsRed.T4 형태의 RFP 발현을 주도합니다.
UAS-세포질GFP ;; P{UAS-GFP. S65T}블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)여러 재고 사용 가능(예: #1522)UAS 조절 서열에 의한 GFP의 S65T 버전의 발현; S65T 변형은 증가된 밝기를 나타냅니다.
UAS-photoconvertible카에데 w1118;; P{UAS-Kaede.A}3블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)#의 26161Kaede 단백질은 합성 후 밝은 녹색 형광을 방출하지만 자외선 조사시 밝고 안정적인 적색 형광으로 효율적으로 변화합니다.
GFP 태그 스파게티 스쿼시 w1118;; P{sqh-GFP.RLC}블루밍턴 초파리 주식 센터(인디애나 대학교)#57145C-말단 말단에 T:Avic\GFPS65T 태그로 태그된 sqh 코딩 영역은 천연 sqh 프로모터의 제어하에 발현됩니다.
플라이 푸드 미디어용 재료플라이 푸드 미디어는 표준 절차에 따라 만들어집니다(Greenspan, R. 1997 참조). Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics(파리 밀기: 초파리 유전학의 이론과 실제). 콜드 스프링 하버 프레스. 1-191쪽)
옥수수Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)공급업체에 직접 문의유기농
Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)공급업체에 직접 문의유기농
맥아 추출물Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)공급업체에 직접 문의유기농
당밀Wild Oats, Bristol, UK (또는 이에 상응하는 공급업체)공급업체에 직접 문의유기농
Difco 한천BD 바이오사이언스, 피셔 사이언티픽재질 보기 DF0142-15-2플라이 푸드 준비를 위해
프로피온산시그마402907플라이 푸드 준비를 위해
니파겐시그마79721플라이 푸드 준비를 위해
말린 빵 효모Redstar, Dutscher Scientific, 영국 LTDRedstar, Dutscher Scientific, 영국 LTD플라이 푸드 준비를 위해
시료 준비 및 장착
파라필름시그마P7793-1개헵탄 접착제의 준비를 위해
고급 세이블 붓Daler-Rowney (또는 이에 상응하는 것)#0 또는 1
집게Fisher Scientific(또는 Fine Science Tools)NC9404145뒤몽 #5
이미징을 위한 유리 바닥 접시매트텍P35G-0-10-C코팅되지 않은 최소 10mm Microwell, 0.085-0.13mm 커버 유리와 함께 35mm 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 더 큰 마이크로웰이 있는 접시를 사용하면 단일 실험에서 더 많은 수의 번데기를 장착하고 이미지화할 수 있습니다.
헵탄시그마51730-5ML헵탄 접착제의 준비를 위해
양면 접착 테이프(예: 스카치)한천 사이언티픽아그263헵탄 접착제의 준비를 위해
50ml 튜브(헵탄 접착제용)Fisher Scientific의 팔콘 튜브번호 14-432-22헵탄 접착제의 준비를 위해
유리 현미경 슬라이드한천 사이언티픽AGL4244Drosophila pupae의 해부용
명시야를 이용한 실체 현미경 해부Leica (또는 동급)M50Drosophila pupae의 해부용
마이크로 가위존 와이스 국제공항103123미니어처 연구 가위 (스트레이트)
레이저 절제 및 이미징
니토겐 절제 레이저Spectra-Physics (또는 Andor equivalent)모델: VSL-337ND-S상처의 경우 광시야 이미징 시스템에 연결해야 합니다
다중 레이저 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)Leica (또는 동급)Leica DMi8 도립 형광 현미경(또는 동급)에 부착된 TCS AOBS SP8 또는 SP5-II이상적으로는 다중 사이트 및 '모자이크' 스캐닝을 위한 전동 스테이지와 '하이브리드' GaAsP 검출기(훨씬 더 높은 감도와 낮은 신호 증폭 제공)를 포함합니다.
환경 챔버라이프 이미징 서비스(또는 이에 상응하는 서비스)"현미경 온도 제어 시스템"이미징 중 온도 제어를 위해 컨포칼 현미경에 부착
이미지 분석 소프트웨어
FRAP 소프트웨어 모듈Leica (또는 동급)CLSM FRAP 소프트웨어 모듈Kaede와 같은 광변환 가능한 형광단의 광변환을 수행하기 위해
ImageJ (이미지 분석 소프트웨어)미국 국립보건원(NIH)https://imagej.nih.gov/ij/Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH 이미지를 ImageJ로: 이미지 분석 25년". 네이처 메소드 9, 671-675, 2012.
ImageJ 플러그인 "수동 추적"미국 국립보건원(NIH)https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ 플러그인 "TrackMate"이미지J, NIHhttps://imagej.net/TrackMate티네베즈, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: 단일 입자 추적을 위한 개방적이고 확장 가능한 플랫폼.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (고성능 3D 이미징 소프트웨어)퍼킨 엘머볼로시티 6.3이미지 분석용
IMARIS(이미지 분석 소프트웨어)비트플레인세포 생물학자를 위한 IMARIS이미지 분석용
가루

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