$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 박테리아 배양 및 제제
참고: 이 프로토콜에 사용된 박테리아 종은 캡슐화된 악성 균주인 B. anthracis Ames입니다. 이 종에 대한 모든 조작에는 적절한 생물 안전 및 보안 허가가 필요하며 BSL-3 실험실에 위치한 클래스 II 또는 클래스 III 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. BSL-3 작업 및 박테리아 취급 시 개인 보호 장비 사용에 대한 기관 운영 절차를 따르십시오.
- BHI 분말 37g을 물 1L에 녹이고 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 뇌 심장 주입(BHI) 육수를 준비합니다. 육수는 주변 온도에서 보관하십시오.
- 물에 8% 중탄산나트륨 용액을 준비하고 0.20μm 필터 주사기를 사용하여 살균합니다. 용액을 4 °C에서 보관하고 1 일 이내에 사용하십시오.
- 영양 육수 8g, 효모 추출물 3g, 한천 15g을 물 1L에 섞어 NBY 한천 플레이트를 준비합니다. 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다. 페트리 접시에 붓고 굳어지게 합니다. 플레이트는 4 °C에서 보관하십시오.
메모: NBY 한천 플레이트는 중탄산나트륨을 포함하거나 포함하지 않고 만들 수 있습니다. 국물과 한천 플레이트에 중탄산나트륨을 첨가하면 캡슐화된 간균으로 구성된 점액질 집락의 성장을 유도합니다. 액체 및 고체 매체에서 중탄산나트륨의 최종 농도는 0.8%입니다.
- 50% 오토클레이브 BHI 육수, 40% FBS 및 10% 중탄산나트륨 용액(v/v)을 혼합하여 B. 탄저병에 대한 배양 육수를 준비합니다.
메모: 이 육수는 캡슐화된 간균의 짧은 사슬을 생성하도록 제조되었습니다.
- B. anthracis의 마스터 플레이트를 준비하여 육수에서 배양하기 하루 전에 포자 스톡의 NBY 한천 플레이트에 분리를 위해 줄무늬를 만듭니다. 37 °C에서 배양합니다.
- 통풍이 잘되는 250mL 플라스크에 30mL의 배양 배지에 B. 탄저병 여러 콜로니를 접종합니다.
메모: 여기에 명시된 바와 같이 육수의 특정 부피 대 표면 비율은 최대로 캡슐화된 간균을 생산하는 데 필요합니다.
- 125rpm, 37°C에서 20% CO2 및 습도 18–24 h.
에서 육수 배양을 흔듭니다.
메모: 37°C 이상의 온도에서 B. 탄저병을 성장시키면 캡슐 생성이 억제될 수 있습니다.
- 인도 잉크로 네거티브 염색을 사용하여 충분한 캡슐화를 보장하고 고정 전에 간균이 짧은 사슬(1-5 간균/사슬)에 있는지 확인합니다(섹션 2 참조).
- 집락 형성 단위(CFU)를 측정하려면 배양 100μL를 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액에 1:10으로 연속적으로 희석하고 양 혈액 한천 플레이트에서 플레이트 배양 희석을 합니다. 37°C에서 12-18시간 동안 배양합니다. CFU를 계산하고 배양 mL당 박테리아 수를 결정합니다.
메모: 박테리아가 고정되면 현미경으로 혈구계를 사용하여 계수를 수행할 수도 있습니다. 그러나 저배율에서는 간균을 보기 어렵기 때문에 권장하지 않습니다.
- 16% PF의 최종 농도에서 4% PF의 전체 박테리아 배양량에 16% 파라포름알데히드(PF)를 추가하여 간균을 고정합니다. 상온에서 7일 동안 셰이커에서 천천히 교반합니다.
메모: 4% PF의 7일 배양은 식물생균 고정을 위한 미국 육군 감염병 의학 연구소(USAMRIID)의 기관 표준 운영 절차를 기반으로 합니다.
- 고정제를 제거하고 멸균 여부를 테스트하려면 ≥3000 x g에서 45분 동안 원심분리하고 PBS로 30mL/세척하여 50mL 원뿔형 튜브에 고정 박테리아 현탁액 4mL(10% 용량)를 세 번 세척합니다. 나머지 샘플을 4°C에서 4% PF로 보관하십시오.
메모: 펠릿 후, 박테리아 펠릿은 캡슐의 존재로 인해 푹신합니다. 세탁 중 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 생존 가능성 테스트를 방해하지 않도록 모든 정착물을 제거해야합니다. 필요한 경우 세탁 횟수를 늘리십시오.
- 생존력 테스트를 위해 40mL의 박테리아 성장 배지(예: BHI 육수)에 세척된 현탁액 4mL(≤액 부피의 10%)를 접종하고 37°C에서 7일 동안 배양합니다. 탁도를 측정하기 위해 7일 전후에 600nm에서 광학 밀도를 확인합니다.
- 육수 배양에서 7일 동안 배양한 후, ≥100μL의 육수를 한천 플레이트에 플레이트하고 다시 7일 동안 배양합니다. 탁도가 증가하지 않고 플레이트에서 성장이 보이지 않으면 원래 배양액은 무균으로 간주되어 BSL-2 실험실로 옮겨질 수 있습니다.
참고: Federal Select Agent Program은 비활성화된 B. 탄저병은 샘플의 완전한 무균성을 입증한 후에만 BSL-3 실험실에서 이전할 수 있도록 규정하고 있습니다. 불활성화형 B. 탄저병에 대한 생존력 검사는 샘플의 10%를 7일 동안 배양한 후 7일 동안 고체 배지에서 배양하는 것으로 구성됩니다. 불임이 확립되면 이전 승인을 받기 위해 기관 지침을 따르십시오.
2. 캡슐화 및 간균 사슬을 관찰하기 위한 음성 염색 및 광학 현미경
검사
- 현미경 슬라이드에서 5μL 박테리아 현탁액과 2μL 인도 잉크를 혼합합니다. 기포가 발생하지 않도록 서스펜션 위에 1 또는 1.5μm 두께의 커버 유리를 놓습니다.
메모: 매니큐어를 사용하여 커버 유리를 슬라이드에 밀봉할 수 있습니다.
- 광학 현미경에서 40x에서 100x 오일 대물 렌즈를 사용하여 박테리아 현탁액을 관찰합니다. 각 박테리아를 둘러싼 클리어런스 영역(캡슐은 인도 잉크를 제외함)을 관찰하여 간균이 캡슐화되어 있고 간균 사슬이 짧은지 확인합니다.
3. 박테리아의 FITC 라벨링
- 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 2mg/mL의 농도로 디메틸설폭사이드에 용해시킵니다.
- 비활성화된 박테리아 스톡의 부피를 측정합니다.
- 정착액을 제거하기 위해 PBS에서 육수를 3 번 씻습니다.
- 최종 농도 75μg/mL에서 FITC 용액을 추가합니다. 4 ° C에서 18-24 시간 동안 혼합물을 천천히 저어줍니다.
- ≥3000 x g, 45분에서 펠릿화하여 박테리아를 세 번 세척하고 30mL PBS/세척을 사용하여 과도한 FITC를 제거합니다. 푹신한 펠릿이 세탁하는 동안 방해받지 않도록 하십시오. 동일한 시작 볼륨에서 PBS에서 간균을 재현탁합니다.
- 분취액을 추출하여 사용할 때까지 -20°C의 마이크로튜브에 보관하십시오. 간균이 캡슐을 잃을 수 있으므로 간균을 여러 번 동결/해동하지 마십시오.
4. 세균 옵소니제이션
- 가열 블록에서 30분 동안 56°C에서 소량의 테스트 혈청(인간이 아닌 영장류, NHP에서)을 가열하여 비활성화합니다.
- 15000 x g에서 3-5분 동안 펠렛화하여 FITC로 표지된 박테리아를 PBS 2x로 해동 및 세척합니다. 동일한 시작 부피로 PBS에 재현탁합니다.
- 96웰 원형 바닥 플레이트(플레이트 #2)에서 테스트 혈청을 세포 배지에서 연속적으로 희석합니다. 또 다른 96웰 원형 바닥 플레이트(플레이트 #3)에서 각 웰에 10μL의 희석된 테스트 혈청을 추가합니다.
메모: 모든 플레이트에서 PBS와 정상 원숭이 혈청이 희석된 테스트 혈청 대신 음성 대조군으로 포함되었습니다. 또한 다른 날에 수행된 모든 분석을 정규화하기 위한 표준 곡선을 생성하기 위해 하나의 테스트 혈청을 양성 대조군으로 선택했습니다. 양성 대조군 테스트 혈청은 풍부했기 때문에 임의로 선택되었습니다.
- 플레이트 #3에 갓 재구성한 아기 토끼 보체 10μL를 추가합니다.
메모: 재구성되면 남은 아기 토끼 보충제를 버리십시오. 재냉동 및 해동하지 마십시오.
- 플레이트 #3에 1:20의 감염 다중성을 위해 적절한 부피의 FITC 표지 간균을 추가합니다. 예를 들어 5 x 104 세포에 대해 5 x 104 x 20 간균이 포함된 볼륨을 추가합니다. 플레이트 #3의 각 웰을 총 105μL.
의 적절한 부피의 셀 배지로 채웁니다.
메모: 세포를 포함하는 플레이트 #1은 100μL의 옵소니화된 박테리아를 받고 나머지 5μL는 공극 부피로 받습니다. 테스트 혈청의 각 희석액을 중복하여 테스트했습니다.
- 플레이트 # 3을 37 ° C에서 30 분 동안 5 % CO2의 존재 하에서 습도와 함께 배양하여 간균을 옵소니화합니다.
5.포유류 세포의 부착 분석 및 형광 표지
- 사용하기 전에 모든 시약을 37°C로 유지하십시오.
- 부착 세포가 포함된 플레이트 #1을 37°C 가열 블록에 놓습니다.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 웰에서 사용한 배지를 제거하고 플레이트 #3에서 100μL의 옵소니화된 박테리아로 신속하게 교체합니다. 피펫팅하는 동안 웰에 기포가 생성되지 않았는지 확인하십시오. 플레이트 # 1을 37 ° C에서 5 % CO2와 습도로 30 분 동안 배양하여 접착시킵니다.
- 37°C 가열 블록 위에 150μL PBS로 각 웰을 5회 세척하여 부착되지 않은 간균을 제거합니다.
메모: 세척 중에 세포가 우발적으로 분산되지 않도록 주의해야 합니다.
- 16% PF를 PBS 1:4로 희석하여 4% PF를 만듭니다. 각 웰에 150μL를 추가하여 4% PF로 셀을 1시간 동안 고정합니다. PBS로 세포를 2번 세척합니다.
- 10mL PBS에 2μL HCS(High-Content Screening) 주황색 세포 염색을 혼합합니다. 이 염색 용액 150μL를 고정된 세포에 첨가하고 상온에서 30분 동안 배양합니다.
- PBS로 우물을 2번 세척합니다.
- 현미경 검사가 이루어질 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
6. 현미경 검사
참고: 일반적으로 고처리량 자동 형광 현미경은 OAA의 이미징을 용이하게 합니다. 자동화 시스템을 사용할 수 없는 경우 부착성 간균의 형광 이미지를 수동으로 촬영할 수 있습니다. 이 연구에서는 특수 장비와 함께 Zeiss 700 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용하여 부착성 간균 및 세포 단층을 이미지화했습니다. 당사의 시스템은 자동 스테이지가 장착된 Zeiss Axio Observer Z1 도립 현미경, Definite Focus 모듈, 40 x NA 0.6 대물렌즈, Axio Cam HRc 카메라 및 Zen 2012(Blue Edition) 소프트웨어로 구성되었습니다. 획득된 이미지는 컨포칼 이미지가 아닌 광시야 이미지입니다. 다음 프로토콜은 다양한 자동 현미경 시스템에 적용할 수 있는 기본 현미경 설정을 위한 것입니다.
- 플레이트 #1을 주변 온도에서 30분 동안 배양하고 현미경 및 관련 장비를 켭니다.
메모: 주변 온도에서의 순응은 이미징 중에 유리판에 응결이 형성되는 것을 방지합니다. 또한 온도 변화로 인한 초점 흐리기를 방지합니다.
- 플레이트를 무대에 놓고 명시야 또는 위상차를 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.
- 플레이트 설정으로 96웰 형식을 선택합니다. 채널 설정을 선택합니다.
메모: FITC의 최대 여기 및 방출 파장은 495/519nm입니다. HCS 주황색 세포 염색은 556 및 572 nm입니다. 현미경에서 사용할 수 있는 필터에 따라 다른 형광단이 사용될 수 있습니다.
- 타일 모드 설정을 선택합니다. 획득할 이미지 수를 나타냅니다.
메모: 타일링 기능을 사용하면 샘플 웰의 여러 위치를 캡처할 수 있으며 타일링 또는 임의 형식으로 이미지를 획득하도록 설정할 수 있습니다. 유정당 10개의 무작위 영역을 이미지화했습니다.
- 획득 모드를 "흑백" 또는 "흑백"으로 변경하고 2x2.
≥ 비닝으로 변경합니다.
메모: 비닝을 1x1에서 2x2 또는 4x4로 설정하면 현미경 검사 속도가 빨라지지만 이미지의 해상도가 낮아집니다. OAA의 경우, 분석이 대식세포와 부착 박테리아를 모두 열거하므로 이러한 설정을 사용하는 것으로 충분합니다.
- 자동 초점 또는 초점 모듈을 켭니다. 자동 초점 기능을 얼마나 자주 수행해야 하는지 표시합니다. 사용 가능한 경우 Z 스택 기능을 켭니다. 세포 단층의 두께와 부착 bacilli.
메모: 선택한 Z 스택의 수는 현미경 검사 시간을 증가시키지만 각 Z 스택에서 올바른 초점의 이미지를 촬영할 수 있습니다.
- 이미지를 저장할 파일 폴더를 지정합니다. 자동 이미징 프로그램을 실행합니다.