광활성성 펩타이드 MHC를 사용한 제어된 T 세포 활성화 평가

초록

출처: Sanchez, E., et al. 광활성 작용제를 사용한 T 세포 활성화의 공간적 및 시간적 제어. J. Vis. 특급 (134), (2018년)

이 비디오는 UV 조사를 사용하여 광활성 펩타이드-주요 조직적합성 복합체를 감소시키는 방법을 보여줍니다. 디케이징 과정은 네이티브 펩타이드 염기서열을 노출시켜 정확한 T 세포 활성화를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 자극 유리 표면의 준비

1. 증류수 탈이온수(ddH₂O)에 1:500으로 희석된 비오틴화 폴리-L-라이신(Bio-PLL)으로 8웰 챔버 커버글라스를 코팅합니다. 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
2. H₂O로 세척하십시오.
3. RT에서 2시간 동안 건조합니다.
4. RT에서 30분 동안 차단 완충액(HEPES 완충 식염수[10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl], 2% BSA 포함)으로 Bio-PLL 코팅 표면을 차단합니다.
   1. 5mg의 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드를 1mL의 10mM NaPO4, pH 8.5에 용해시킵니다.
   2. 125μmol(0.55mg)의 NHS-비오틴(DMSO의 100mg/mL 스톡에서)을 추가하고 반응의 pH를 확인합니다. pH가 8.5 미만인 경우 2μL의 4N NaOH를 첨가하여 pH 8.5에서 9.5 사이로 올립니다.
   3. 30분 동안 소용돌이
   4. 20mM Tris pH 8.0에 용해된 50μL의 100mM 글리신으로 반응을 담금질합니다.
   5. 10분 동안 최대 전력으로 회전하고 상등액을 새 튜브로 옮깁니다.
      참고: Bio-PLL 품질은 일반적으로 96웰 ELISA 플레이트에 재료의 연속 2배 희석액을 코팅하고 알칼리성 인산가수분해효소 결합 스트렙타비딘으로 배양한 후 비오틴 함량을 정량화하여 이전 제제와 비교합니다.
5. 차단 버퍼를 제거합니다. 우물이 마르지 않도록 하십시오. 스트렙타비딘(차단 완충액에 100μg/mL)을 추가합니다. 4 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
6. HBS에서 세척하십시오. 챔버 슬라이드 웰을 4 - 5회 채우고 뒤집어 웰에서 HBS를 제거합니다. 우물이 마르지 않도록 하십시오.
7. 비오틴화된 pMHC 리간드와 접착 분자를 표면에 추가합니다.
   메모: MCC 및 OVA는 주요 리신의 ε-아미노 그룹(MCC의 K12, OVA의 K7)에 오르쏘-니트로벤질 기반 보호기(예: 니트로페닐에틸(NPE) 또는 니트로베라트릴옥시카르보닐(NVOC))을 추가하여 광경화할 수 있습니다. Photocaged MCC 및 OVA는 상업용 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. 수성 완충액에서 재구성 후, 확립된 접근법을 사용하여 박테리아로 발현된 I-E^k 및 H2-K^b로 재접힙니다.
8. 광활성성 MCC 또는 OVA 펩타이드 검증
   1. RT에서 20분 동안 휴대용 UV 램프(재료 표 참조)로 UV 조사하여 NVOC 보호 펩타이드를 감소시킵니다.
   2. 1μM의 비자극 펩타이드(음성 대조군, 예: Hb), 조사되지 않은 광활성 펩타이드, 조사된 광활성 펩타이드 및 작용제 펩타이드(양성 대조군, 예: MCC)로 1.0 x 10⁵ APC를 37°C에서 1시간에서 하룻밤 동안 펄스합니다.
   3. 5C를 발현하는 T 세포를 자극한다. C7/2B4/및 TCR은 CH12 또는 CH27 B 셀을 사용합니다. OT1 T 세포를 자극하려면 RMA-s 또는 EL4 흉선종 세포를 사용합니다.
   4. 펄스된 APC를 96웰 원형 바닥 플레이트에 동일한 수의 T 세포와 최종 부피 200μL로 혼합합니다. 37°C에서 12 - 24시간 동안 배양합니다.
   5. 각 웰에서 상등액을 회수하고 streptavidin-horseradish peroxidase 비색 검출을 사용하여 ELISA로 IL-2를 분석합니다.
      참고: MHC 복합체로 다시 접히기 전에 전기 분무 질량 분석법으로 모든 펩타이드의 케이지 상태를 확인하는 것이 좋습니다.
9. 빛에 대한 노출을 최소화하기 위해 MHC의 접기 및 정화를 수행합니다. 예를 들어, 접힘 반응을 알루미늄 호일로 감싸고 UV 램프를 끈 상태에서 겔 여과 크로마토그래피를 수행합니다.
   메모: 광활성성 MCC- I-E^k 및 OVA- H2-K^b는 불완전한 기능적 케이징으로 인해 고밀도에서 UV 독립 T 세포 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, 광활성성 pMHC는 고정화 단계에서 10 - 30배 이상의 비자극성 pMHC(예: 헤모글로빈 펩타이드(Hb)를 포함하는^I-Ek)로 희석됩니다. 이것은 후속 이미징 실험의 신호 대 잡음비를 향상시킵니다.
10. CD4⁺ T 세포를 광활성화하기 위해 클래스 I MHC H2-K^k(0.5μg/mL)에 대해 비오틴화된 Hb-I-Ek(3μg/mL), 비오틴화된 광활성제 MCC-I-E^k(0.1μg/mL) 및 비오틴화된 항체의 혼합물을 집합적으로 사용합니다. 항-H2-K^k 항체는 5C를 촉진합니다. C7/2B4/AND T 세포는 H2-K^k를 발현하여 활성화되지 않고 유리 표면에 퍼집니다.
11. CD8⁺ T 세포의 경우, 펩타이드 KAVYDFATL이 함유된 비오틴화된 H2-Db(1 μg/mL), 비오틴화된 광활성 OVA-H2-Kb(0.1 μg/mL) 및 접착 분자 ICAM-1(곤충 세포 배양으로 생성된 2 μg/mL)의 세포외 도메인의 혼합물을 사용합니다. ICAM-1은 T 세포 표면에 인테그린 LFA1을 결합시켜 밀접 접촉 형성을 촉진합니다.
12. 모든 단백질 혼합물을 차단 완충액에 적용한 다음 RT에서 1시간 또는 4°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
    메모: 이러한 종류의 표면의 분자 밀도는 μm2 당 ~ 8000으로 이전에 결정되었습니다. 광활성성 pMHC가 표면에 있는 비오틴화 단백질의 ~1/30을 나타낸다는 점을 감안할 때, 밀도는 감소하기 전에 μm2당 ~267 분자가 될 것입니다.
13. 1.6단계와 같이 세척하고 사용할 준비가 될 때까지 HBS에 그대로 둡니다.
14. 적절한 TCR을 발현하는 200,000개의 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포를 각 웰에 추가하고 세포가 37°C에서 15분 동안 접착되도록 합니다. 세포가 표면에 부착되어 퍼지면 광활성화 및 이미징을 수행할 준비가 된 것입니다.
    메모: 형광 이미징 프로브를 사용한 effector T 세포의 레트로바이러스 형질도입은 다른 곳에서 자세히 설명되어 있습니다. 칼슘 신호전달은 칼슘에 민감한 염료인 Fluo-46이 함유된 전달되지 않은 T 세포를 사용하여 연구할 수도 있습니다. 비율계량 염료 Fura-2는 UV 범위에서 여기(excitation)가 필요하기 때문에 권장되지 않으며, 이는 또한 광활성성 pMHC의 감소를 유도합니다.

2. 이미지 획득

1. 이미지 획득을 위해 UV 호환 150X 대물 렌즈가 장착된 도립 TIRF 현미경을 사용하십시오. 100W 수은 램프(HBO)에 부착된 디지털 다이어프램 시스템을 사용하여 사용자 정의 영역을 UV로 조사합니다. 이 램프의 UV 광선을 400nm 장역 통과 미러를 사용하여 샘플로 직접 보냅니다.
2. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 국부적인 광활성화 및 타임 랩스 획득을 수행할 수 있습니다. 대부분의 실험에서는 각각 488nm 및 561nm 여기 레이저를 사용하여 녹색 및 빨간색 채널 모두에서 프로브를 모니터링합니다. 레이저 광은 UV 범위에서도 투과하는 이중 대역 통과 이색성 거울을 사용하여 샘플로 향합니다(디케이징을 가능하게 하기 위해). 현미경 구성에 대한 추가 정보는 재료 표와 그림 1을 참조하십시오.
3. T 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 장착한 후 필요에 따라 TIRF 또는 에피 형광 조명을 얻기 위해 설정을 조정합니다. 라이브 모드에서, 관심 있는 형광 프로브를 발현하는 세포 필드를 선택합니다. 소프트웨어 제어를 사용하여 개별 세포 아래에 광활성화를 위한 미크론 규모의 영역을 설정합니다.
4. 타임랩스 획득을 시작합니다. 일반적으로 80개의 시점이 획득되며 각 시점 사이에는 5초의 간격이 있습니다. 이것은 이중 색상 실험의 경우 순차적인 488nm 및 563nm 노출을 위한 충분한 시간을 남겨둡니다.
5. 10개의 시점 후 디지털 다이어프램 셔터를 1 - 1.5초 동안 열어 선택한 영역을 광활성화합니다.
6. 타임랩스가 완료되면 새 셀 필드를 선택하고 프로세스를 반복합니다.

결과

그림 1: 광활성화 및 TIRF 이미징을 위한 현미경 구성.

488nm 및 561nm 레이저는 각각 녹색 및 빨간색 프로브의 TIRF 및 epifluorescence 이미징에 사용됩니다. 광활성화를 위한 자외선은 작은 사용자 정의 영역을 비출 수 있는 디지털 다이어프램 시스템에 부착된 수은(Hg) 램프에서 가져옵니다. Hg 램프/다이어프램에서 나오는 빛은 이미징 레이저를 반사하는 이색성 거울 아래에 위치한 장역 통과 거울에 의해 샘플에 반사됩니다. 이색성 거울은 자외선을 통과하도록 설계되어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스	Thermofischer 사이언티픽	155361
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드	시그마-알드리치	P2636	비오틴화 폴리-L-라이신을 만들어야 합니다
EZ-Link NHS-비오틴	Thermofischer 사이언티픽	20217	비오틴화 폴리-L-라이신을 만들어야 합니다
스트렙타비딘	Thermofischer 사이언티픽	434301
BirA-500: BirA 비오틴-단백질 리가아제 표준 반응 키트	어비디티	바이A500	단백질을 비오틴화하는 데 사용됩니다.
비오틴화 Hb I-EK			단백질 접힘에 대해서는 참고 문헌 6을 참조하십시오. 비오틴화의 경우 BirA 키트를 사용하십시오
비오틴화 NPE-MCC I-EK	아나스펙		맞춤형 NPE-MCC(HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH)는 Anaspec에서 구입할 수 있습니다
Biotinylated αH2-Kk 항체	BD 바이오사이언스	553591
비오틴화 NPE-OVA H2-Kb	아나스펙		사용자 정의 NPE-OVA(H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH)는 Anaspec에서 구입할 수 있습니다
비오틴화 KAVY H2-DB	아나스펙		맞춤형 합성 단백질(KAVYDFATL)은 Anaspec에서 구입할 수 있습니다
비오틴화 ICAM1			단백질 접힘에 대해서는 프로토콜의 참조를 참조하십시오. 비오틴화의 경우 BirA 키트를 사용하십시오
휴대용 UV 램프	증권 시세	UVGL-25	램프는 샘플에서 1cm < 떨어져 있습니다. 365광의 30초는 검출 가능한 디케이징에 충분하고 20분은 정량적 디케이징에 충분합니다.
올림푸스 IX-81 OMAC TIRF 시스템.	올림푸스		이미징 시스템에 대한 추가 정보는 그림 6에서 확인할 수 있습니다.
모자이크 디지털 다이어프램	안도르
슬라이드북 소프트웨어	지능형 이미징 혁신