$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 인간 CD4 + Th1 이펙터 / 메모리 T 세포 준비
- 기증자의 팔에 지혈대를 바르고 알코올로 정맥을 닦고 바늘을 삽입합니다. EDTA를 항응고제로 사용하여 15ml의 혈액을 액츄에이터에 천천히 뽑습니다. 혈액을 채취한 후, 바늘을 제거하기 전에 지혈대를 푸십시오. 바늘을 제거했을 때는 즉시 멸균 거즈로 상처 부위를 압박한다.
- 혈액을 50ml 튜브로 옮깁니다. RPMI-1640을 RT에서 1:1 희석(최종 부피 30ml)으로 추가합니다. RT에서 Ficoll-Paque와 같은 사전 여과된 림프구 분리 배지 15ml가 들어 있는 2개의 50ml 튜브에 희석된 혈액을 조심스럽게 오버레이합니다.
- 스윙 버킷 로터에서 1,200 x g에서 30분 동안 RT에서 그래디언트를 원심분리합니다. 원심분리하는 동안 T 세포 배지(RPMI-1640 500ml, FCS 50ml, 페니실린/스트렙토마이신 5ml)를 준비합니다.
- 원심분리기에서 50ml 튜브를 제거한 후 바닥에 있는 적혈구 펠릿, 백혈구(림프구 포함)를 포함하는 세포층인 파크, 혈장의 4개 층을 관찰합니다. 파스퇴르 피펫으로 백혈구층을 조심스럽게 제거하고 50ml 팔콘 튜브에 옮깁니다.
- RT RPMI-1460(최대 20ml)을 첨가하고 1,200 x g에서 5분 동안 RT에서 원심분리하여 백혈구층을 세척합니다. T 세포 배지 1ml에 백혈구를 재현탁합니다. 1.5ml 원심분리 튜브에 5μl의 1ml 세포 현탁액을 250μl T 세포 배지에 넣고 피펫으로 위아래로 부드럽게 혼합합니다.
- 25μl 0.4% Trypan blue에 25μl 희석된 세포 현탁액을 추가합니다. 표준 혈구계의 각 면에 10μl의 혼합물을 추가합니다.
- 혈구계를 저전력 광학 현미경에 놓습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 Trypan blue dye를 제외하고 혈구계 양쪽의 중간 사각형에 존재하는 살아있는 세포의 수를 계산합니다.
- 세포 농도를 계산하려면 2개의 제곱의 평균에 100(희석 계수)을 곱한 다음 104를 곱하여 세포/ml의 수를 구합니다.
- T 세포 배지에서 최종 농도를 0.5 x 106 cells/ml로 조정합니다. 박테리아 초항원, 포도상구균 장독소 B(SEB) 및 독성 쇼크 증후군 독소 독소 1(TSST)을 각각 1μg/ml의 최종 농도를 세포에 추가합니다. CD4+ T 세포 집단을 확장하기 위해 72시간(37°C 및 5% CO2) 동안 배양합니다.
- T 세포(1,200 x g, 5분)를 펠렛화하고 인간 IL-15(20ng/ml)를 첨가하여 T 세포 배지에서 0.5 x 106 cells/ml로 재현탁합니다. 림프구를 T150 플라스크로 옮깁니다. 필요에 따라 24-48시간마다 전체 medium-IL-15에서 세포를 계속 확장/분할합니다(미디어 색상 기준; 즉, 미디어가 분홍색에서 약간 노란색으로 바뀔 때마다) 그 후. 결과 림프구 개체군을 최대 15일 동안 유지합니다.
메모: 설계상 이 프로토콜은 SEB 및 TSST에 반응하는 CD4+ T 세포의 하위 집합을 구체적으로 활성화하고 확장한 다음 Th1 유사 효과기/메모리 표현형으로 유도합니다. 다른 백혈구는 이러한 조건에서 생존 및 성장하지 못하므로 1.10단계까지 세포는 유세포 분석으로 쉽게 평가할 수 있는 95% 이상의 CD4+, CD45RO+ T 세포가 됩니다. 원하는 경우, 시판되는 항체/자기 비드 기반 positive or negative selection kit를 통해 추가 정제를 쉽게 달성할 수 있습니다.
2. 1차 인간 내피 세포 배양 시작
- 멸균 조건에서 PBS에 피브로넥틴(FN) 20μg/ml로 T25 플라스크를 코팅합니다. RT에서 30-60분 동안 그대로 둡니다. FN을 제거하고 5ml의 완전 배지(내피 성장 배지(EGM-2) 단일표본이 보충된 내피 기저 배지(EBM-2) 배지)를 추가합니다. 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 최소 30분 동안 사전 배양합니다.
- 얼어붙은 인간 폐 또는 피부 미세혈관 내피 세포(HLMVEC 또는 HDMVEC)의 바이알을 37°C 수조에서 ~2-3분 동안 가끔 부드럽게 교반하면서 해동합니다. 예열된 배지가 들어 있는 T25 플라스크로 세포를 즉시 이동합니다. 부드럽게 휘저어 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
- ~4-6시간 후에 미디어를 교체합니다. 플레이트가 ~90-95% 농도에 도달할 때까지 약 48시간마다(또는 미디어가 약간 노란색으로 변할 때) 미디어를 계속 교체합니다.
3. 내피 세포의 일반적인 분열 및 확장
- 세포를 ~90-95 농도로 성장시킵니다. 2-5일이 소요될 수 있습니다. 분할의 경우 미디어를 제거하고 PBS로 헹굽니다. PBS를 제거하고 최소 용량의 신선한 1x 트립신(T25의 경우 0.5ml, T75의 경우 1.5ml)으로 교체합니다. 부드럽게 소용돌이쳐 모든 표면을 트립신으로 덮습니다. 37 °C에서 ~ 5 분 동안 배양하십시오. 저전력 광학 현미경을 사용하여 플레이트에서 세포의 분리를 모니터링합니다.
- 대부분의 세포가 둥글거나 분리된 것처럼 보이면 예열된 완전한 EGM-2 배지 5부피(즉, 추가된 트립신 부피와 비교)를 추가하고 플라스크 표면에 부드럽게 피펫으로 올려 모든 세포를 분리합니다.
- 1.6-1.7에 설명된 대로 혈구계로 내피 세포를 계산합니다. 원심분리(5분, 1,200 x g)로 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거합니다. 예열된 완전한 EGM-2 MV 배지를 추가하여 ml당 50만 세포로 농도를 조정합니다.
- 유지 관리를 위해 세포의 부분 표본을 적절한 FN 코팅 접시 또는 플라스크로 옮깁니다. 부드럽게 소용돌이치며 인큐베이터에 넣습니다. 도금 후 6-12시간 이내에 용지를 교체하십시오. 그 후 약 48시간마다 미디어를 교체해야 합니다.
4. 내피 세포 형질주입
참고: 일차 내피 세포는 가장 일반적인 화학 및 전기천공법(electroporation method)에 의한 transfection에 불응합니다. 하기 기술된 핵 형질주입 기반 방법은 상대적으로 높은 형질주입 효율(~50-70%)을 허용한다. 효과적인 대체 방법은 적절한 바이러스 벡터에 의한 감염을 사용하는 것입니다(재료 표의 설명 참조).
- HLMVEC 또는 HDMVEC의 T25 또는 T75 플라스크(필요에 따라)를 최종 밀도 90-95% 농도로 준비합니다. 멸균 조건에서 PBS에 피브로넥틴(FN) 20ug/ml로 코팅하고, Delta-T 플레이트(5단계)와 같은 현미경 배양 플레이트(5단계) 또는 12mm 원형 유리 커버슬립을 24웰 세포 배양 플레이트(6단계)의 웰 내부에 배치하고 위에서 설명한 대로 코팅합니다(2.1).
- 완전한 EGM-2 배양 배지 1ml를 현미경 배양 플레이트에 추가하거나 가습된 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 각 24웰 및 평형 플레이트에 0.5ml를 추가합니다.
- 3.1-3.3 단계에서와 같이 내피 세포를 수확하고 계수합니다. 필요한 부피의 세포(샘플당 50만 개 세포)를 RT에서 5분 동안 1,200 x g로 원심분리합니다. 샘플당 100 μl RT 핵 transfection 용액에 세포 펠렛을 조심스럽게 재현탁합니다.
- 100 μl의 세포 현탁액과 1-5 μg DNA를 결합합니다. 세포/DNA 현탁액을 인증된 큐벳으로 옮깁니다. 샘플은 기포 없이 큐벳 바닥을 덮어야 합니다.
참고: 세포막에 대한 YFP 또는 DsRed를 표적으로 하는 구축물(번역 후 팔미토일화에 대한 신호를 포함하는 뉴로모듈린의 N-말단 20 아미노산을 통해)을 단독으로 사용하거나(membrane-YFP 단독 또는 membrane-DsRed 단독) 세포질 부피 마커(예: membrane-YFP 및 용해성 DsRed)와 함께 형질주입했습니다. 형광 단백질 마커의 많은 순열을 사용할 수 있습니다.
- 캡으로 큐벳을 닫습니다. cell/DNA suspension이 있는 큐벳을 electroporator의 큐벳 홀더에 삽입하고 electroporation program S-005 (전기천공법) S-005를 적용합니다. 프로그램이 완료되면 홀더에서 큐벳을 꺼냅니다.
- ~500 μl의 사전 평형 배양 배지를 큐벳에 추가하고 nuclear transfection kit에 제공된 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 큐벳에서 세포 현탁액을 부드럽게 제거합니다.
- 현미경을 사용한 실험의 경우, 배양 플레이트는 예열된 배지를 포함하는 두 접시 사이에서 하나의 반응으로 인한 세포 현탁액을 균등하게 분할합니다(단계 4.2-4.3). 24개의 웰/플레이트를 사용하는 실험의 경우, 3개의 웰 간에 하나의 반응을 균등하게 분배합니다.
- 가습된 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하고 4-6시간 후에 배지를 교체하고 transfection 후 12-16시간에 다시 배양합니다.
5. 라이브 셀 이미징 및 분석
- 내피 준비
- Day 0: 4단계에 설명된 대로 핵 절제 기술을 통해 membrane-YFP 및 용해성 DsRed와 1차 HLMVEC를 동시 transfection하고 생세포 이미징 배양 플레이트에 플레이트합니다.
- 1일차: MHC-II 발현을 유도하기 위해 배지를 IFN-γ(100ng/ml)을 함유한 새 배지로 교체합니다. 2일차. 기존 배지에 20ng/ml TNF-α를 첨가하여 형질주입된 세포를 자극합니다.
- 3일차에 실험 직전 30-60분 동안 37°C에서 세균성 초항원인 포도상구균 장독소 B(SEB) 및 독성 쇼크 증후군 독소 1(TSST)을 각각 1μg/ml씩 내피에 배양합니다. '-Ag' 제어 조건에 대해서는 이 단계를 생략합니다.
- 림프구 준비
- 단계 5.1.3과 병행하여 20mM HEPES, pH 7.4 및 37°C로 예열된 0.5% v/v 인간 혈청 알부민이 보충된 완충액 A(페놀 레드가 없는 HBSS)를 준비합니다. 배양된 림프구 샘플을 채취하여 혈구계로 계수하여 밀도를 측정합니다(단계 1.12-1.17).
- 15ml 코니컬 튜브에서 1,200 x g에서 실온에서 5분 동안 샘플당 200만 개의 세포를 원심분리합니다. 배지를 흡입하고 세포 클러스터가 남지 않도록 2ml의 버퍼 A에 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다.
- Fura-2 칼슘 염료의 새로운 분취액을 제거하고 DMSO에 재현탁하여 1mM의 스톡 농도를 만듭니다.
- T 세포 현탁액(최종 농도 2μm)에 Fura-2 원액 2μl를 추가하고, 튜브를 덮고, 염료의 균일한 분산을 보장하기 위해 튜브를 뒤집어 즉시 혼합합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양합니다.
- 5.2.2단계와 같은 원심분리기. Buffer-A를 흡입하고 20-40 μl의 새로운 Buffer-A에 림프구를 부드럽지만 철저하게 재현탁시킵니다.
- 라이브 셀 이미징 설정 및 획득
참고: 정립 및 도립 광 현미경에서 라이브 셀 형광 이미징을 위해 다양한 시스템을 사용할 수 있습니다. 기본 요구 사항에는 형광 광원 및 필터, CCD 카메라, 전동 필터 스위칭 및 셔터, 가열 스테이지(또는 현미경 장착형 가열 챔버) 및 자동 이미지 획득을 위한 소프트웨어가 포함됩니다. 이 프로토콜의 경우 필요한 공간 해상도를 달성하기 위해 높은 개구수와 고배율(즉, 40X, 63X) 오일 이멀젼 렌즈가 필요합니다. Fura-2 기반 칼슘 이미징을 위한 적절한 형광 소스와 렌즈를 선택할 때 필요한 340/380nm 여기 파장과 호환되는 것은 아니므로 특별한 주의를 기울여야 합니다. 비율계량에 민감하지 않은 칼슘에 민감한 염료(예: Fluo-4, Rhod-3)와 함께 대체 접근법(표준 녹색 및 적색 형광 필터 세트와 호환)을 사용할 수 있지만, 이러한 방법은 칼슘 플럭스를 정확하게 정량화할 수 없으며 상대적/정량적 판독값만 제공합니다.
- 현미경 시스템(작동용 PC, 현미경, CCD 카메라, 필터 휠, 크세논 lamp).
- 지정된 소프트웨어를 엽니다.
- 자동화된 다중 채널 타임 랩스 이미징을 위한 현미경/소프트웨어를 설정합니다. 미분 간섭 대비(DIC), 표준 녹색 형광, 표준 적색 형광, 표준 340 및 380nm 여기 Fura-2 이미지의 순차 획득을 포함합니다. 획득 간격을 10-30초로 설정하고 총 지속 시간을 ~20-60분으로 설정합니다.
- Fura-2 이미징을 위한 노출 시간을 설정합니다.
- 새 대물렌즈를 넣고 0.5ml의 Buffer-A만 들어 있는 현미경 접시를 가열에 장착합니다.tage 어댑터하고 즉시 켜서 37°C로 평형을 이룹니다(~2-3분 소요).
- 20μl 피펫을 사용하여 장착된 현미경 접시 챔버에 휴지 Fura2 로딩 림프구를 추가합니다.
- 명시야 이미징을 켭니다. 접안렌즈로 가는 광 경로를 선택합니다. 거친 초점 손잡이를 사용하여 대물렌즈를 현미경 접시 바닥과 접촉시킵니다. 접안렌즈와 미세 초점 손잡이를 사용하여 접시 바닥에 있는 T 세포에 초점을 맞춥니다.
- x-y 스테이지 컨트롤을 사용하여 10개 이상의 셀이 포함된 필드를 선택합니다. 과도하게 밀집된 필드와 세포 덩어리는 이미징 아티팩트를 생성하므로 피하십시오.
- 명시야에서 형광등으로 전환합니다. 접안렌즈 이미징에서 CCD 카메라로 전환합니다. 획득 매개변수(예: 노출 시간, 검출기 게인 및 비닝)를 설정합니다. 소프트웨어를 사용하여 휴지 Fura2-340 및 Fura2-380 이미지를 획득합니다(각각에 대해 동일한 노출 시간부터 시작, 일반적으로 ~200-1,000mssec 범위).
- 5.4.1단계에 설명된 방법을 사용하여 각 림프구에 대한 Fura2-340/Fura2-380을 계산합니다. 평균값이 1에 가까워질 때까지 Fura2-340 및 Fura2-380 노출 시간 조정, 이미지 획득 및 비율 계산을 반복하여 수행합니다.
- mem-YFP 및 DsRed의 노출 시간을 설정합니다.
- 5.3.3.1단계에서 사용된 현미경 접시를 세포 배양 인큐베이터에서 형질 주입, 활성화 및 SAg 처리(또는 처리되지 않은, 대조군) HLMVEC 또는 HDMVEC가 들어 있는 현미경 접시로 교체합니다(단계 4.5.1). 일회용 전사 피펫을 사용하여 매체를 빠르게 제거하고 예열된 Buffer-A ~1ml를 추가하여 한 번 헹굽니다. 흡입 후 Buffer-A 0.5ml를 첨가합니다.
- 밝은 형광 양성 transfectant 내피 세포가 존재하고 잘 형성된 세포 간 접합부로 건강하게 보이는 필드를 식별합니다.
- mem-YFP 및 DsRed에 대한 획득 매개변수(예: 노출 시간, 검출기 게인 및 비닝)를 조정합니다. 각 채널의 평균 형광 신호 강도가 검출기 동적 범위의 25%에서 75% 사이인지 확인하십시오.
- 라이브 셀 이미징 실험을 수행합니다.
- 자동화된 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득을 시작하고 여러 이미지 간격을 캡처하여 기준선을 설정합니다.
- 획득하는 동안 소량(P-5 또는 P-20) 피펫의 팁을 대물렌즈 중앙에 가까운 매체에 삽입하고 천천히 배출하여 농축된 Fura-2 로딩 림프구(단계 5.2에서) ~5μl를 현미경 접시 이미징 필드의 중앙에 적용합니다.
- 림프구가 이미징 영역에 정착함에 따라 초점에서 T 세포-내피 세포 인터페이스(면역학적 시냅스)가 초점면에서 유지되도록 초점을 미세 조정합니다. 40 및 63X 대물렌즈의 경우 필드당 ~10-20개의 셀이 최적입니다. 이미징 필드에서 관찰되는 세포 수가 더 적으면 5.3.4.2단계를 반복합니다.
- 실험의 원하는 관찰 간격이 완료된 후 이미징을 계속하고 즉시 ionomycin을 현미경 접시에 직접 피펫팅하여(5.3.4.2와 같은 기술 사용) 최종 농도 2μM까지 유도하여 최대 칼슘 플럭스/Fura-2 신호 신호(즉, 보정 수단, 분석 5.4 참조).