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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 유방암 발병의 형질전환 마우스 모델
- 진행하기 전에 촉진 또는 캘리퍼스 측정을 통해 적절한 종양 성장을 위해 원하는 암 모델의 마우스를 관찰합니다.
메모: 여기에서는 유방암 발병의 형질전환 쥐 모델(FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J)(MMTV-PyMT)을 사용하였다. 이 동물들은 각 유선에서 생후 6주에서 12주 사이에 자발적으로 침습성 유방암이 발생합니다. 정상 유선은 전이유전자 음성, 연령이 일치하는 새끼의 대조군으로 사용되었습니다.
2. 특이 및 비특이적 항체 제제의 정맥 주사
- 탈염 컬럼(예: PD-10)에서 토끼 항-마우스 B7-H3 및 토끼 면역글로불린 G(IgG) 이소타입 제어 항체를 정제하여 제조업체 지침에 따라 방부제 및 저장 버퍼를 제거합니다.
메모: 일부 항체는 Protein-A 아가로스 비드 기반 프로토콜로 추가 정제가 필요할 수 있습니다.
- 개별 마이크로 원심분리기 튜브에서 각 항체 접합체 33μg의 부분 표본 투여량.
메모: 투여되는 제제의 용량은 응용 프로그램에 따라 다를 수 있으며 항체 접합체가 일상적으로 사용되는 용량과 일치합니다. 동물 안전을 위해 부피가 100μL 이상인 경우 항체 용액의 농도가 필요합니다.
- 조직 채취 전 원하는 시점(여기서는 96시간)에 2L/분의 속도로 산소가 흐르는 2% 이소플루란으로 종양 보유 동물을 마취하고 37°C의 가열된 스테이지에 놓습니다. 시술 전에 적절한 마취 수준에 도달했는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다.
- 항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비하기 위해서는 동물의 꼬리를 알코올 물티슈로 3회 닦아 소독합니다. 꼬리 정맥을 약 30초 동안 열 패드로 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 확장시킵니다. 동물 전체를 가열하지 마십시오. 열 패드를 제거한 후 알코올 천으로 꼬리를 한 번 더 닦습니다.
- 27G 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 나비 바늘을 삽입하고 삽입 된 바늘로 꼬리를 수술 테이프 조각으로 조심스럽게 무대에 고정합니다.
메모: 카테터로 들어가는 눈에 보이는 혈액 역류는 꼬리 정맥 내에서 바늘의 적절한 위치를 나타냅니다.
- 25μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 카테터를 플러시한 다음 인슐린 주사기를 사용하여 항체 용액을 카테터에 주입합니다. 25μL의 멸균 PBS로 카테터를 다시 한 번 세척합니다.
- 꼬리에서 바늘을 제거하고 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.
- 마취를 끄고 완전히 깨어날 때까지 동물에게 고통의 징후가 없는지 관찰합니다.
3. 표적 종양 조직의 수집 및 준비
- 원하는 시점에서, 수용 가능한 제도적 절차에 따라 동물을 인도적으로 안락사시키며, 여기서 챔버 변위 유량이 10-30% 부피/분
인 압축 가스 탱크에서 100% CO2를 점진적으로 흡입합니다.
메모: IVIL 기술의 일부 응용 분야는 자유롭게 순환하는 항체를 제거하기 위해 PBS를 사용한 심장 관류에 의한 안락사를 필요로 합니다.
- 호흡 및 심장 운동 중단, 발가락 끼임 반응 부족, 점막의 회색화를 통한 인도적 안락사를 확인한 후 다음과 같이 수술용 가위와 집게를 사용하여 종양 조직을 절제합니다.
- 마우스를 누운 자세로 눕히고 꼬리에 가장 가까운 유선(5번째) 사이의 피부층 만 집게로 잡고 수술용 가위로 작게 절개합니다.
- 닫힌 가위를 절단 부위에 넣고 끝을 천천히 열어 밑에 있는 복벽막에서 피부를 조심스럽게 분리하여 손상되지 않도록 합니다.
- 복부를 수직으로 절개하여 내막에서 피부를 계속 분리합니다. 제3 유선과 제4 유선(Madmary glands between the third and fourth mammary glands) 사이에서 복부를 가로질러 수평으로 절단하여 피부를 후퇴시키고 유선을 시각화할 수 있도록 합니다.
메모: 유선과 땀샘은 표면적으로 피부 아래에 위치합니다.
- 집게로 각 종양이나 정상선을 잡고 수술용 가위를 사용하여 부착된 피부를 조심스럽게 잘라냅니다.
- 절제된 조직을 일회용 조직 기본 주형에 넣고, 사전 라벨링하고 최적 절단 온도(OCT) 매립 매체로 채운 다음, 드라이 아이스에 올려 주형을 빠르게 동결합니다. off-target 전달을 연구하려면 다른 관심 조직 또는 기관(예: 간 또는 폐)을 절제합니다.
메모: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하려면 진행할 준비가 될 때까지 동결 조직 블록을 -80°C에서 보관하십시오.
- 저온 유지 장치를 사용하여 10μm 두께의 동결 조직 블록을 절단하고 인접한 절편을 사전 라벨링된 접착 유리 슬라이드에 놓습니다.
메모: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하려면 계속 진행할 준비가 될 때까지 -80°C에서 슬라이드를 보관하십시오.
4. Ex vivo 염색 프로토콜
참고: 형광 현미경 이미지 간의 정량적 비교를 위해 모든 슬라이드는 동일한 준비된 용액으로 동시에 염색됩니다.
- OCT를 제거하기 위해 실온 PBS로 냉동 조직 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다.
- 염색하는 동안 필요한 용액의 양을 줄이기 위해 소수성 장벽 펜으로 조직 단면을 구분합니다.
메모: 펜이 조직 샘플 위로 흐르지 않도록 주의하십시오.amp슬라이드에서 조직을 제거하거나 영향을 받는 조직 부분의 적절한 염색을 방해할 수 있습니다. 조직 부분이 어떤 지점에서도 탈수되지 않도록 하십시오.
- 조직 절편을 4% 파라포름알데히드 용액으로 5분 동안 고정합니다.
- PBS에서 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다.
- PBS에서 0.5% Triton-X 100으로 조직 절편을 15분 동안 투과시킵니다.
- PBS에서 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다.
- 실온에서 1시간 동안 PBS(차단 용액)에서 3% w/v 소 혈청 알부민(BSA) 및 5% v/v 염소 혈청으로 조직을 차단합니다.
메모: 차단 용액 혈청을 2차 항체 숙주 동물에 일치시킵니다.
- PBS에서 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다.
- 원하는 경우 기록을 보관하는 1차 항체, 즉 일반적인 핵(예: DAPI), 혈관(예: CD31) 또는 세포질 마커(예: actin)로 절편을 배양합니다. 여기서, 1:100 희석된 랫드 안티 마우스 CD31(혈관 마커)을 제조업체의 지침에 따라 슬라이드 트레이에서 탈수로부터 보호된 4°C에서 밤새 차단 용액에 사용했습니다.
메모: 1차 항체 또는 항체 접합체를 추가로 추가하지 마십시오. 주입되어 in vivo 조직에 축적되도록 방치된 접합체는 1차 항체로 작용합니다.
- PBS에서 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다., 매번 PBS를 변경하면서 세 번 헹굽니다.
- 1차 항체를 라벨링하기 위해 슬라이드를 2차 항체로 배양합니다. 이 응용 분야의 경우, AlexaFluor-546 접합 염소 항토끼 항체(1:200 희석, 제조업체 지침에 따라 최적화됨)를 사용하여 항-B7-H3 항체를 시각화하고 AlexaFluor-488 염소 항-쥐 2차 항체(1:200 희석, 제조업체 지침에 따라 최적화)를 차단 용액에서 방출 용액에 넣고 슬라이드 트레이에서 실온에서 1시간 동안 CD31을 시각화합니다.
메모: 2차 항체는 동일한 숙주 동물에서 유래하지만 2차 항체의 친화력과 각 1차 항체의 숙주 종과 일치합니다. 슬라이드는 이 시점부터 빛으로부터 보호됩니다.
- PBS에서 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다., 매번 PBS를 변경하면서 세 번 헹굽니다.
- 장착 매체 한 방울을 조직 슬라이스 중앙에 바르고 기포가 갇히지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
- 커버슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉하고 건조시킵니다.
메모: 이 시점에서 최대 일주일 동안 프로토콜을 일시 중지하려면 진행할 준비가 될 때까지 슬라이드를 -20°C에서 보관하십시오.
5. 컨포칼 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석
참고: 컨포칼 현미경 및 이미징 매개변수 준비는 사용되는 컨포칼 시스템에 따라 다릅니다. 여기에 사용된 현미경은 상업적으로 구매했으며(예: Zeiss LSM 510 Meta 시스템) 관련 수집 소프트웨어(예: Zen 2009)를 사용했습니다. 그러나 이러한 단계 중 다수는 모든 컨포칼 현미경에 적용되며 기본적인 컨포칼 현미경 지식을 가정합니다.
- 시스템을 켜고 예열한 후 원하는 대물렌즈를 선택합니다. 여기서는 20x(개구수 = 0.8) 대물렌즈가 사용되었습니다.
- 포지티브 컨트롤 슬라이드를 로드하고 커버슬립 다운하여 가장 밝은 신호에 대한 최적화를 설정할 수 있습니다. 빨간색 채널의 이미징, 라이브 이미징 모드에서 샘플에 시스템 초점을 맞춥니다.
- 사용된 각 레이저 채널에 대해 다음과 같이 레이저 강도, 마스터 게인 및 핀홀 크기를 최적화합니다.
- 이미징을 위해 연속 모드로 전환합니다.
- LUT(Look Up Table) 히스토그램을 모니터링하면서 Laser Intensity(레이저 출력 제어) 및 Gain(Master)(광전자 증배관의 전압 제어) 슬라이드 바를 최적화합니다. 픽셀을 포화시키지 않고 히스토그램의 동적 범위가 채워질 때까지 이 두 설정을 조정합니다.
메모: 레이저 강도가 너무 높으면 광표백이 발생합니다. 게인(마스터)이 너무 높으면 이미지에 노이즈가 발생합니다. 이상적으로는 게인(마스터)이 해당 범위의 중간에 있습니다.
- 핀홀을 가장 높은 해상도와 가장 얇은 z 슬라이스를 제공하는 1AU(Airy Unit)로 설정합니다.
- 디지털 오프셋 막대를 밀어 LUT 히스토그램의 노이즈 플로어를 최소화하여 진정한 검은색 배경을 만듭니다.
메모: 각 레이저 채널과 대물렌즈에 대해 현미경 설정이 최적화되면 이미징 세션 내내 그리고 모든 슬라이드의 이미징에 대해 일관되게 유지하여 슬라이드 간의 정량적 비교가 가능합니다.
- Acquisition Mode 탭의 Averaging에서 원하는 Number 및 Bit Depth를 선택합니다. 최적 버튼을 클릭하여 최적의 픽셀 크기를 설정합니다.
- Snap 획득 버튼을 사용하여 고품질 이미지를 수집합니다. 여기에서는 종양 내에서 무작위 시야를 선택했지만 다른 관심 영역(혈관, 종양 가장자리, 침투 깊이 등)에 다른 관심 영역이 적용될 수 있습니다.
- 오프라인 처리 및 정량화를 위해 컨포칼 소프트웨어에서 사용하는 형식(여기서는 ".lsm")으로 이미지 파일을 저장합니다.
메모: 동일한 세션 동안 모든 슬라이드가 이미지화되지 않은 경우 설정을 저장하고 다음 방문 시 다시 로드하지만 광표백으로 인해 동일한 슬라이드를 다시 이미징하는 것은 권장되지 않습니다.
- 정량적 형광 강도 측정을 수행합니다. Fiji(Fiji Is Just ImageJ 소프트웨어)를 열고 .lsm 이미지 파일을 상태 표시줄로 끌어 로드합니다.
- 색상 채널 데이터를 분할합니다. 이미지 > 스택 > 분할 채널로 이동합니다.
- 필요에 따라 형광 이미지를 전처리하거나, 즉, 배경 신호를 빼거나(Process > Subtract Background) 필터링 방법을 통해 노이즈를 줄입니다.
- 신호 강도에 대한 임계값을 설정하여 기준 단백질(혈관, 핵, 세포 염색)에 해당하는 색상 채널을 분할합니다(이미지 > Adjust > Threshold).
메모: 수동 임계값 적용은 이미지 분석에 주관성을 도입하므로 자동화된 임계값 지정 알고리즘을 사용하거나 이미지 히스토그램을 참조하면 이미지 분석 결과의 편향을 줄일 수 있습니다.
- 이 임계값을 사용하여 이진 마스크(Process > Binary > Convert to Mask)를 만듭니다.
- 마스크 내에서 ROI를 측정하고 레이블을 지정합니다(Analyze > Analyze Particles를 > Add to Manager > OK를 선택합니다).
- 관심 항체에 해당하는 색상 채널에 ROI를 적용합니다(채널 이미지 클릭, > 도구 분석 > ROI 관리자 > 측정). 이렇게 하면 마스크 ROI가 항체 이미지에 적용되고 결과 창에서 라벨 섹션에 대한 이미지 측정값이 제공됩니다. 결과 저장 창(파일 > 저장).
- 여기에 설명된 대로 평균 형광 강도와 같은 원하는 관심 통계량을 계산합니다.
- 슬라이드 세트 내의 각 이미지에 대해 모든 처리 단계를 동일하게 수행합니다. 큰 이미지 배치에 대해 이 작업을 자동으로 수행하는 매크로를 만듭니다.
- 정량적 측정 후에만 이미지를 표시하려면 정성적 이미지 조정을 적용하여 모든 슬라이드에서 최소, 최대, 밝기 및 대비를 동일한 수준으로 조정하여 생체 분포 패턴의 시각화를 최적화합니다(이미지 > 밝기/대비 조정 >).
- 이미지 유형(이미지 > 유형 > RGB 색상)을 변환하고 프리젠테이션 및 출판물에 사용하기 위해 .tiff(파일 > > Tiff 저장 등)과 같은 무손실 이미지 유형으로 파일을 저장합니다.