타액에서 병원체 특이적 항체를 식별하기 위한 비드 기반 다중 면역 분석

초록

출처: Augustine, S. A. J., et al. 환경 병원체에 대한 인체 노출을 측정하기 위한 타액 항체 다중 면역 분석 개발. J. Vis. 특급 (2016).

이 동영상은 인간 타액에서 여러 환경 병원체에 대한 항체를 동시에 검출하는 비드 기반 다중 면역분석 기술을 보여줍니다. 형광 구슬은 인간 타액 샘플의 항체를 사용하여 캡처된 다른 병원체의 항원에 결합되었습니다. 형광 리포터를 사용하여 항체를 라벨링한 후, 타액 내 다양한 병원체 특이적 항체의 존재를 평가하기 위해 유세포 분석을 사용하여 비드를 분석했습니다.

프로토콜

1. 비드 커플 링

1. 표 1에 표시된 농도를 사용하여 항원을 bead sets에 결합합니다.
2. 활성화된 비드에 각 항원을 추가하고 50mM MES, pH 5.0에서 총 부피를 500μl로 가져옵니다. 소용돌이에 의해 항원과 비드를 혼합합니다.
3. 항원과 비드를 어두운 곳에서 실온에서 회전(~15rpm)으로 혼합하여 2시간 동안 배양합니다. 10,000 x g에서 2분 동안 마이크로 원심분리를 통해 결합된 비드를 펠렛
화합니다.
4. 상층액을 제거하고 볼텍스 및 초음파 처리에 의해 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)-소 혈청 알부민(BSA)-폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Tween-20)-아지드나트륨(PBS-TBN) 500μl에 비드를 재현탁합니다. 10,000 x g에서 2분 동안 미세 원심분리로 비드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.
   주의: 아지드화나트륨은 급성 독성이 강한 화학 물질입니다. 삼키거나 피부에 닿으면 치명적입니다. 먼지/연기/가스/미스트/증기 또는 스프레이를 흡입하지 마십시오. 관련 법률에 따라 취급 및 폐기할 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
5. 볼텍스와 초음파 처리로 1ml의 PBS-TBN에 비드를 20 초 동안 재현탁시킵니다.
6. 10,000 x g에서 2분 동안 마이크로 원심분리로 비드를 펠렛
화합니다.
7. 1.5 및 1.6.
   단계를 반복합니다. 메모: 이를 통해 PBS-TBN으로 총 2회 세척할
수 있습니다.
8. 결합 및 세척된 비드를 PBS 1ml, 1% BSA, 0.05% 아지드, pH 7.4에 재현탁합니다. 결합 된 비드는 어두운 곳에서 2-8 ° C 냉장고에 보관하십시오.

2. 타액 다중 면역분석

1. -80°C 냉동고에서 타액을 제거하고 실온에서 해동합니다.
2. 항원 결합 비드 스톡을 와류와 초음파 처리로 20초 동안 재현탁합니다.
3. PBS-1% BSA 완충액에 결합된 비드 스톡을 각각 고유한 비드 세트의 최종 농도 100 beads/μl로 희석하여 작업 비드 혼합물을 준비합니다.
4. 96웰 딥 웰 플레이트에 PBS-1% BSA 완충액으로 타액을 1:4 희석하여 준비합니다.
5. 필터 플레이트에 100μl의 세척 버퍼를 미리 적시고 진공으로 상층액을 제거합니다.
6. 1:8 최종 희석을 위해 50μl의 작업 비드 혼합물과 동일한 부피의 희석된 타액을 96웰 필터 플레이트의 95웰에 추가합니다. 반응을 멀티채널 피펫터와 혼합합니다. 하나의 대조군 웰에 50μl의 항원 결합 비드와 50μl의 PBS-1% BSA 완충액을 추가합니다(타액 대체품).
7. 뚜껑을 덮고 실온의 어두운 곳에서 500rpm의 마이크로플레이트 셰이커에서 1시간 동안 배양합니다. 진공으로 상층액을 제거하십시오. 100μl의 세척 완충액으로 웰을 세척하고 진공으로 상층액을 제거합니다. 세척 1회를 반복합니다.
8. 멀티채널 피펫터를 사용하여 50μl의 PBS-1% BSA에 비드를 재현탁합니다.
9. PBS-1% BSA에서 비오틴화 염소 항인간 IgG 2차 검출 항체를 16μg/ml로 희석합니다.
10. 각 웰에 50μl의 희석된 2차 항체를 추가하고 내용물을 다채널 피펫터와 혼합합니다.
11. 필터 플레이트를 덮고 플레이트 셰이커에서 30분 동안 실온의 어두운 곳에서 배양합니다. 진공으로 상층액을 제거하십시오. 100μl의 세척 완충액으로 웰을 세척하고 진공으로 상층액을 제거합니다. 세척 1회를 반복합니다.
12. 멀티채널 피펫터를 사용하여 50μl의 PBS-1% BSA에 비드를 재현탁합니다.
13. 스트렙타비딘-R-피코에리트린 리포터(SAPE)를 PBS-1% BSA에서 24μg/ml로 희석합니다.
14. 각 웰에 50 μl 리포터를 추가하고 멀티채널 피펫터와 혼합합니다.
15. 필터 플레이트를 덮고 플레이트 셰이커에서 30분 동안 실온의 어두운 곳에서 배양합니다. 진공으로 상층액을 제거하십시오. 100μl의 세척 완충액으로 웰을 세척하고 진공으로 상층액을 제거합니다. 세척 1회를 반복합니다.
16. 100 μl의 PBS-1% BSA에 비드를 재현탁하고 분석기를 사용하여 50 μl를 분석합니다.
    메모: 다중 면역분석법의 결과는 MFI(Median Fluorescence Intensity) 단위로 측정됩니다. 오류를 방지하기 위해 사용 가능한 경우 항상 최신 버전의 소프트웨어 설명서를 참조하십시오.

표 1: 멀티플렉스 면역분석법을 위한 작업 비드 믹스.커플링 및 확인이 완료된 후, 각 비드 세트로 구성된 마스터 믹스를 그림과 같이 준비했습니다. 마스터 믹스는 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배되었습니다. 모든 웰은 비드와 PBS-1% BSA 완충액만 함유된 하나의 배경 대조군 웰을 제외하고 타액으로 배양되었습니다.

의 의 명 의 분 분 의 명 의 의 개 의 명 의 분 분 의 명 의 의 개 의 명 의 의 개 의 명 의 의 의 명 개 의 명

항원	비드 세트	커플링 버퍼	Ag 농도 (μg)	# 1 모서리에 구슬 수	# 비드/μL	Vol. 100 B/uL의 경우 4 ml (μl)
C. 제주니	8	MES 5.0	50	64	6,400	94
H. 파일로리	33	MES 5.0	25	71	7,100	85
A형 간염	42	MES 5.0	100	91	9,100	66
T. 곤디	30	MES 5.0	25	85	8,500	71
노로바이러스 GII.4	55	MES 5.0	5	72	7,200	83
노로바이러스 GI.1	67	MES 5.0	5	63	6,300	95
분리됨	80	MES 5.0		60	6,000	100
		구슬의 총 부피 (μl)				594
		필요한 총 버퍼 부피(μl)				3,406

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장비 및 소프트웨어
마이크로 원심분리기	써모 일렉트론 코퍼레이션	75002446	시료를 원심분리하는 데 사용
와류 믹서	폭스바겐	G560	시료 혼합에 사용
초음파 처리기 (미니)	피셔 사이언티픽	Tel.: 15-337-22	구슬을 분리하는 데 사용됩니다.
피펫터 P10, P20, P100, P1000, 8 채널.	캡	다양한
멀티스크린 진공 매니폴드	밀리포어	MSVMHTS00	상층액을 제거하기 위한 세척 단계에서 사용
마이크로셰이커	폭스바겐	제12620-926	배양 중 비드를 교반하는 데 사용됩니다.
튜브 랙 (1.5mL 및 0.5mL) (분류)	폭스바겐	제30128-346
저울	Mettler 또는 기타		완충액을 만들기 위한 세척 시약을 측정하는 데 사용됩니다.
Dynabead 시료 믹서	인비트로젠	947-01	커플링 배양 단계에서 사용
매트랩(R2014b)	매스웍스(The MathWorks, Inc.)		항체 반응 데이터를 분석하는 데 사용됩니다
마이크로소프트 엑셀 2014	마이크로소프트 주식회사		항체 반응 데이터를 분석하는 데 사용됩니다
Luminex 분석기(xPonent 3.1 소프트웨어 포함	주식회사 루미넥스	LX200-XPON3.1	분석을 실행하는 데 사용되는 기기 및 소프트웨어
항
GI.1 Norwalk 바이러스 : p-입자	시장(CCHMC)*	해당 없음	*신시내티 아동 병원. 최종 농도 5 μg.
GII.4 노로바이러스 VA387 : p-입자	시장(CCHMC)*	해당 없음	*신시내티 아동 병원. 최종 농도 5 μg.
A형 간염 바이러스 : 세포 배양에서 추출한 2등급 농축액	메리디안 생명과학	8505	100 μg에서 항원 결합
Helicobacter pylori : 용해물	메리디안 생명과학	R14101	25 μg에서 항원 결합
톡소플라즈마 곤디이 : 재조합 p30 (SAG1)	메리디안 생명과학	R18426	25 μg에서 항원 결합
캄필로박터 제주니 : 열이 전체 세포를 죽였습니다	KPL	50-92-93	50μg에서 항원 결합
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비오틴-SP-활용 AffiniPure 당나귀 항염소 IgG (H+L)	잭슨	Tel.: 705-065-149	커플 링 확인에 사용
비오틴화 토끼 항염소 IgG (H+L)	KPL	16-13-06	커플 링 확인에 사용
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친화력 정제 항체 비오틴 표지 염소 항 인간 IgG (γ)	KPL	16-10-02	타액 면역분석법에 사용
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1.5mL 코폴리머 마이크로 원심분리기 튜브	미국 과학	1415-2500	낮은 결합 마이크로 원심분리기 튜브로 사용
10 μL 피펫 팁 리필	바이오벤처스	5030050씨
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1000 μL 피펫 팁 리필	바이오벤처스	5130140씨
알루미늄 호일	다양한 공급 업체		배양 중에 구슬을 어둠 속에 보관하는 데 사용됩니다
딥 웰 플레이트	폭스바겐	제40002-009	타액 샘플을 희석하는 데 사용
멀티스크린 필터 플레이트	밀리포어	MABVN1250	어세이 실행에 사용됨
Oracol 타액 채취 시스템	Malvern 의료 개발 제한		타액 채취에 사용
시약
카르복실화된 미세구체(비드)	주식회사 루미넥스	비드 세트에 따라 다름	항원은 미세구에 결합되어 있습니다.
EDC (1- 에틸 -3- [3 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 염산염)	뚫다	77149 또는 22980	비드 활성화에 사용됨
설포-NHS(N-하이드록시설포숙신이미드)	뚫다	24510	비드 활성화에 사용됨
스테타비딘-R-피코에리트린(1mg/mL)	분자 프로브	에스-866	기자로 사용
MES (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산)	시그마	엠-2933	커플 링에 사용
Tween-20(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트)	시그마	P-9416	비특이적 결합을 제거하기 위해 세척 버퍼에 사용됨
단백질 완충액
PBS-TBN 차단/저장 버퍼(PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% 아지드, pH 7.4)**			필터 : 4°C에서 살균 및 보관
PBS, pH 7.4	시그마	P-3813	138mM NaCl, 2.7mM KCl
증권 시세	시그마	A-7888	0.1% (승/v)
트윈-20	시그마	P-9416	0.2%(V/V)
아지드화나트륨(0.05% 아지드)**	시그마	S-8032	**주의: 아지드화나트륨은 급성 독성이 있습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 적절한 PPE를 착용하십시오. 관련 법률에 따라 폐기하십시오.
MES/ 커플링 버퍼(0.05m MES, pH 5.0)
MES (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산)	시그마	에스-3139
5 N NaOH	어부	SS256-500
분석 버퍼(PBS, 1% BSA, pH 7.4)			필터 : 4°C에서 살균 및 보관
PBS, 1% BSA, pH 7.4	시그마	P-3688	138mM NaCl, 2.7mM KCl, 1% BSA
활성화 완충액 (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			필터 : 4°C에서 살균 및 보관
NaH2PO4 (인산나트륨, 일염기성 무수)	시그마	에스-3139	0.1M 나H2PO4
5 N NaOH	어부	SS256-500
세척 버퍼(PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4)			필터 : 4°C에서 살균 및 보관
PBS, 0.05% 트윈-20, pH 7.4	시그마	P-3563	138mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.05% 트윈

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