인간 식세포에 의한 Fungal Spore Phagocytosis의 정량적 유세포 분석 측정

초록

출처: Hartung, S., et al., 유세포 분석을 사용하여 인간 백혈구에 의한 Aspergillus fumigatus Conidia의 식세포작용 측정. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 인간 백혈구에 의한 FITC 표지 병원성 진균 포자의 식세포작용을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 식세포작용된 포자는 counterstaining을 통해 세포 부착 포자에서 식별한 후 유세포 분석을 수행합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 식세포작용 분석

1. 12웰 세포 배양 플레이트에서 1.5mL의 RPMI + 10% FCS에 2 x 10⁶ 백혈구 및 4 x 10⁶ FITC 표지 분생포자(감염 다중성 = 2)를 배양합니다. 대조군으로는 세포만(분생포자 없음) 및 세포 + 레이블이 지정되지 않은 분생포자(conidia)를 포함합니다.
2. 37°C의 가습된 CO₂ 인큐베이터에 넣고 원하는 시간(예: 0.5시간, 2시간 또는 4시간) 동안 배양합니다.
3. 배양 후 세포 스크레이퍼로 세포를 채취하고 15mL 튜브에 넣습니다.
4. 실온에서 300 x g에서 5분 동안 회전합니다.
5. 사이토카인 분석을 위해 상층액을 수집하거나 원하지 않는 경우 폐기합니다. 100μL의 PBS + 2mM EDTA에서 각 샘플을 재현탁합니다.

2. 항체 염색

1. 표 1에 따라 각 샘플에 대해 APC anti-FITC 항체를 포함한 100μL의 항체 혼합물을 준비합니다.
2. 100μL 샘플을 96웰 V-바닥 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 세척을 위해 150μL PBS + 2mM EDTA를 추가합니다.
3. 색상 보정을 위해 각 색상에 대해 1 x^{10 6} 셀을 96-well V 바닥 플레이트의 추가 웰에 배치합니다. 염색되지 않은 상태로 남아 있는 세포의 우물을 포함하십시오. 세척을 위해 150μL PBS + 2mM EDTA를 추가합니다.
4. 접착 호일로 접시를 덮으십시오.
5. 실온에서 300 x g에서 5분 동안 회전합니다. 호일을 제거합니다.
6. 싱크대 위에 한 번만 또는 일회용 종이 타월로 플레이트를 빠르고 강력하게 뒤집어 상등액을 버리십시오.
   알림: 마를 때까지 종이에 접시를 반복하거나 두드리면 접시에서 세포가 많이 손실될 수 있습니다.
7. 100 μL 항체 혼합물에 세포를 재현탁시키고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
8. 색 보정을 위해 100μL의 PBS + 2mM EDTA에 각 세포를 재현탁하고 항체 혼합물에 사용된 것과 동일한 양으로 각 웰에 단일 항체를 추가합니다.
9. 접착 호일로 덮고 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.
10. 호일을 제거합니다. 세척을 위해 각 웰에 150μL + 2mM EDTA를 추가합니다. 접착 호일로 덮으십시오.
11. 실온에서 300 x g에서 5분 동안 회전합니다. 호일을 제거합니다. 싱크대 또는 일회용 종이 타월 위에 플레이트를 빠르고 강력하게 뒤집어 상등액을 폐기하십시오.
12. 200μL의 PBS + 2mM EDTA에 재현탁하고 각 웰의 세포를 별도의 둥근 바닥 튜브로 이동합니다. 현탁액에 세포 클러스터가 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면 클러스터를 제거합니다.
    참고: 눈으로 볼 수 있을 만큼 큰 모든 클러스터는 잠재적으로 세포 분석기를 막을 수 있을 만큼 큽니다.

3. 유세포 분석

1. 유세포 분석기를 시작하고 예열합니다. 수집 소프트웨어를 시작합니다.
2. 새 실험을 만들고 샘플을 설정하고 레이블을 지정합니다.
3. 형광단 FITC, APC, BUV395, V500 및 PerCP-Cy5.5에 대한 매개변수(FSC 250, SSC 250) 및 검출기를 설정합니다.
4. 보상 설정
   1. 보상 설정을 엽니다.
   2. 개별 색상을 표시합니다.
   3. 염색되지 않은 상태로 남아 있거나 개별 염색이 있는 대조 셀을 사용하여 PMT 검출기 전압을 설정하여 스케일 내의 모든 이벤트를 포함합니다.
   4. 각 컨트롤에 대해 10,000개 이상의 이벤트를 기록합니다.
   5. compensation 설정을 사용하여 형광단의 파급을 계산하고 이를 실험의 세포분석기 설정에 적용합니다.
5. 샘플 데이터 기록
   1. 수집 소프트웨어에 FSC 및 SSC를 표시하고 백혈구 주위에 게이트를 설정합니다.
   2. 백혈구 게이트를 기반으로 SSC/CD45 및 CD45⁺ 세포가 분생포자에서 분리되는 게이트를 표시합니다.
   3. CD45⁺ 세포를 도트 플롯 CD14/CD66b와 게이트 단핵구(CD14⁺) 및 호중구(CD66b⁺)에 별도로 표시합니다.
   4. 호중구를 점도표 anti-FITC/FITC 표시.
   5. 라벨링되지 않은 분생포자가 있는 샘플을 사용하여 anti-FITC 및 FITC 신호에 대한 사분면을 설정하여 각 사분면에 있는 세포의 최대 1%를 허용합니다.
   6. 단핵구 게이트에 대해 3.5.4 및 3.5.5 단계를 반복합니다.
   7. 백혈구 게이트에서 최소 20,000개의 이벤트가 있는 모든 샘플을 기록합니다.

표 1: 유세포분석을 위한 항체 혼합물. 각 시약의 양은 분석할 샘플(1 x 10,⁶ 세포)당 마이크로리터로 제공됩니다.

개 의 개

시약	샘플당 μL
CD45 부브395	1
CD14 V500	0.5
CD66b 퍼CP-Cy5.5	1.5
FITC 반대 APC	0.5
PBS + 2mM EDTA	97
합계	100

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
접착 호일	낙인	701367
세포 배양 플레이트, 12웰	그라이너 바이오 원	665180
세포분석기	BD 바이오사이언스		LSR Fortessa II, 레이저: 488nm(파란색), 405nm(보라색), 355nm(UV) 및 640nm(빨간색)
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	시그마 알드리치	ED3SS-500g	PBS에서 2mM
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)	시그마 알드리치	F3651-100MG	Na2CO3 /PBS 용액에서 0.1mM
인산염 완충 식염수(PBS)	써모피셔 사이언티픽	189012-014	칼슘 없이, 마그네슘 없이
RPMI 1640	써모피셔 사이언티픽	61870010	RPMI 1640 배지, 글루타맥스 보충제
데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어	BD 바이오사이언스
V-바닥 플레이트, 96웰	낙인	781601	처리되지 않은 표면
포름알데히드	칼 로스	PO87.3	히스토픽스

년 년