포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 면역형광 분석

초록

출처: Aulas, A. et al., 세포질 병소를 포유류 응력 과립으로 분류하는 방법.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 mRNA, RNA 결합 단백질(RBP) 및 기타 다양한 단백질로 구성된 포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다.

프로토콜

1. 세포 준비

1. 그림 1A에 표시된 바와 같이 24웰 플레이트의 12웰에 오토클레이브 커버슬립을 추가합니다. 이는 진공 청소기에 부착된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 커버슬립을 픽업하여 수행할 수 있습니다. 우물 측면에 있는 커버슬립을 부드럽게 두드려 흡입을 해제하면 커버슬립이 우물 안으로 떨어질 수 있습니다.
2. 플레이트: 1 x 10, 500μL의 배지의 최종 부피에서 웰당⁵개의 U-2 OS(U2OS) 골육종 세포. 플레이트를 좌우로, 위아래로 여러 번 움직여 셀이 고르게 분포되도록 합니다.
3. 깨끗한 P1000 팁으로 커버슬립을 부드럽게 눌러 커버슬립이 우물 바닥에 있고 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다.

2. 세포에 스트레스 주기

1. 다음 날, 플레이트를 육안으로 확인하여 세포가 균일하게 분산되어 있고 커버슬립 전체에 고르게 합류하는지 확인하는데, 이는 샘플 간의 변동이 결과의 재현성에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 도립 조직 배양 현미경에서 10X 대물렌즈를 사용합니다.
2. 매체를 37 °C로 예열합니다. 차....

결과

그림 1: 실험 다이어그램.(A) 표시된 대로 이전에 24웰 플레이트에 배치된 커버슬립에 종세포를 주입합니다. 표시된 대로 μM 단위의 농도를 사용하여 SA 또는 VRB로 A열과 B열을 60분 동안 처리합니다. 60분 후 약물 함유 배지에 CHX(최종 농도: 컬럼 2의 경우 20μg/mL) 또는 퓨로(컬럼 4의 경우 20μg/mL 퓨로마이신)를 첨가합니다. 고정 및 염색 전에 추가로 30분 동안 배양을 계속합니다. (B) 계수를 위해 이미지화해야 하는 필드를 나타내는 커버슬립 다이어그램. 커버슬립은 대략 동일한 5개의 영역으로 나뉩니다. 각 지역에서 하나의 이미지가 촬영됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
U-2 OS	증권 시세	ATCC®HTB-96™	- 일반적으로 "U2OS" 로 표기 - 37°C에서 10% FBS/DMEM의 5% CO2 이하에서 배양
둘베코의 독수리 매체 변형	코 닝	10-013-이력서	- 약칭 DMEM - 포도당, 피루베이트, 페놀 레드 4.5g/L 함유 - 10% FBS, 10mM HEPES 및 페니실린/스텝토마이신 보충 - 이전 약물 희석 예열 - 사전 예열 이전 약물 희석
소 태아 세럼	시그마	F2442-500ml	- 약칭 FBS - 배지를 보충하는 데 사용됩니다
헤페스 (1M)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15630-080	- 배지를 보충하는 데 사용됩니다
페니실린 스트렙토마이신	시그마	P0781-100ml	- 배지를 보충하는 데 사용됩니다
24웰 플레이트	코스타	3524
실험실 조직	(주)킴텍사이언스	34120	- 일반적으로 "Kimwipes"라고 합니다.
성장 커버 안경용 커버 글라스	피셔 사이언티픽	제12-545-82	- 사용 전 오토클레이브 - 조직 배양 후드에서 멸균 상태 유지
나트륨 (메타) 비소 ≥90 %	시그마	S7400-100G	- 일반적으로 비소나트륨이라고 하며 약칭 SA - 1M 농도로 물에 용해 한 다음 작업 원료로 100μM로 희석합니다.
비노렐빈	TSZ 켐	RS055	- 약칭 VRB - 10mM까지 물에 용해
푸로마이신	시그마	P9620	- 번역 수준(리보푸로마이실화)을 평가하는 데 사용됩니다 - 활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용됩니다. - 물에 10mg/mL로 희석
에메틴 디하이드로클로라이드 하이드레이트	시그마	E2375	- 일반 번역 수준을 평가하기 위해 Puro 와 함께 사용됩니다. - 활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용됩니다. - 물에 10mg/mL로 희석
시클로헥시미드	시그마	C4859	- CHX 약칭 - 활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용됩니다. - 물에 10mg/mL로 희석
인산염 완충 식염수	론자 / VWR	95042-486	- 약칭 PBS - 면역형광을 위한 세척 완충액
파라포름알데히드 시약 등급, 결정질	시그마	P6148-500G	- 흄 후드의 뜨거운 PBS에 4% 용액을 만들고 용해될 때까지 저어줍니다 - 부분 표본은 -20 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다 - 위험한, 환기 사용 - 특수 쓰레기에 버리십시오
메탄올, ACS	증권 시세 표시기 / 폭스바겐	BDH1135-4LP	- 사용하기 전에 -20°C로 사전 냉각 - 특수 쓰레기에 버리십시오
노멀 호스 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31874	- 약칭 NHS - PBS 에서 5%로 희석 - 4°C 에서 보관하기 위해 아지드화나트륨을 첨가합니다. - 면역형광을 위한 차단 용액
에탄올, 순수, 200 프루프 (100%), USP, KOPTEC	데콘 연구소 / VWR	89125-188	- 물로 70%까지 희석
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드	피셔브랜드	제12-550-15
마우스 anti G3BP1 항체 (TT-Y)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-81940	- 4 °C 에서 보관하십시오. - 1/100 희석액에서 사용
토끼 anti eIF4G 항체 (H-300)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-11373	- 4 °C 에서 보관하십시오. - 1/250 희석
Goat anti eIF3η (N-20) 항체	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-16377	- eIF3η는 eIF3b 라고도 합니다. - 4 °C 에서 보관 - 1/250 희석
Cy2 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L)	잭슨 면역 연구	전화: 715-225-150	- 제조업체의 지침에 따라 물에 재구성한 다음 4°C 에서 보관하십시오. - 1/250 희석
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)	잭슨 면역 연구	전화: 711-165-152	- 제조업체의 지침에 따라 물에 재구성한 다음 4°C 에서 보관하십시오. - 1/2500 희석
Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 염소 IgG (H+L)	잭슨 면역 연구	Tel.: 705-175-147	- 제조업체의 지침에 따라 물에 재구성한 다음 4°C 에서 보관하십시오. - 1/250 희석
Hoechst 33258 솔루션	시그마	94403-1ML	- 2 차 항체로 배양 - dH20에서 0.5 mg / mL 저장 용액, 빛으로부터 보호 - 4 °C에서 보관
20 x SSC 버퍼	써모 피셔 앰비온	AM9763	- RNase Free water(DEPC 처리)를 사용하여 2X SSC로 희석- 실온 보관 - FISH용 세척 버퍼
슬라이드 장착 매체	집에서 만든	/	- PBS 20ml에 "냉용성"폴리 (비닐 알코올) 5g을 혼합하십시오.- 초음파 처리로 혼합, RT-글리세롤 5ml와 20 % 아지드 나트륨 0.2ml를 첨가하고 RT-원심 분리에서 16 시간 동안 교반-20 분 동안 20,000g에서 원심 분리, 큰 펠릿 부분 표본 점성 액체를 버리고, -20°C에서 장기 보관, 4°C에서 1주일
파라필름 "M"	시그마	P7793-1개	- 일반적으로 "파라필름"이라고 합니다.
폴리(비닐 알코올)	시그마	P-8136-250G	- 비놀을 만들기 위한 시약
글리세롤	시그마	G5516-100ML	- 비놀을 만들기 위한 시약
아지드화나트륨	피셔 사이언티픽	에스2002-5G	- 차단액 및 vinol 용 방부제 - 물에 20% 희석합니다.

표시기 시리즈 . ) 호 . . 년 호 시리즈 (영문) . . ) 년 호