포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 면역형광 분석

초록

출처: Aulas, A. et al., 세포질 병소를 포유류 응력 과립으로 분류하는 방법.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 mRNA, RNA 결합 단백질(RBP) 및 기타 다양한 단백질로 구성된 포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다.

프로토콜

1. 세포 준비

1. 그림 1A에 표시된 바와 같이 24웰 플레이트의 12웰에 오토클레이브 커버슬립을 추가합니다. 이는 진공 청소기에 부착된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 커버슬립을 픽업하여 수행할 수 있습니다. 우물 측면에 있는 커버슬립을 부드럽게 두드려 흡입을 해제하면 커버슬립이 우물 안으로 떨어질 수 있습니다.
2. 플레이트: 1 x 10, 500μL의 배지의 최종 부피에서 웰당⁵개의 U-2 OS(U2OS) 골육종 세포. 플레이트를 좌우로, 위아래로 여러 번 움직여 셀이 고르게 분포되도록 합니다.
3. 깨끗한 P1000 팁으로 커버슬립을 부드럽게 눌러 커버슬립이 우물 바닥에 있고 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다.

2. 세포에 스트레스 주기

1. 다음 날, 플레이트를 육안으로 확인하여 세포가 균일하게 분산되어 있고 커버슬립 전체에 고르게 합류하는지 확인하는데, 이는 샘플 간의 변동이 결과의 재현성에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 도립 조직 배양 현미경에서 10X 대물렌즈를 사용합니다.
2. 매체를 37 °C로 예열합니다. 차갑거나 뜨거운 매체를 셀에 적용하면 각각 저온 쇼크 또는 열 쇼크를 유발할 수 있으므로 피하십시오.
3. 예열된 매체에 약물을 희석하십시오. 각 약물 농도에 대해 500μL의 배지를 포함하는 2개의 웰을 준비합니다. 파이펫팅 중 손실을 방지하기 위해 추가로 500 μL를 준비합니다. 각각 1.5mL를 함유한 부분 표본 4개의 튜브.
   1. 비소나트륨의 경우: 500μL를 포함하는 각 웰에 100mM 비소나트륨 1.5μL(최종 농도: 100μM)를 첨가하거나 100mM 비소나트륨 0.75μL(최종 농도: 50μM)를 추가합니다.
   2. 비노렐빈의 경우: 500μL를 포함하는 각 웰에 10mM 비노렐빈(최종 농도: 150μM) 22.5μL를 추가하거나 10mM 비노렐빈(최종 농도: 100μM) 18.75μL를 추가합니다.
      메모: 비소나트륨은 특성이 잘 규명되고 일반적으로 사용되는 응력 과립 유도제이므로 고전적으로 양성 대조군으로 사용됩니다.
4. 웰 B1 - 4 및 C1 - 4에서 매체를 제거하고 폐기합니다. 약물이 든 미디어를 추가하고 60분 동안 기다립니다(그림 1A).
   1. 100μM 비소나트륨이 포함된 배지 500μL를 웰 B1 및 B2에 추가합니다. 500μM 비소나트륨이 포함된 배지 500μL를 웰 B3 및 B4에 추가합니다.
   2. 150μM 비노렐빈이 포함된 배지 500μL를 웰 C1 및 C2에 추가합니다. 125μM 비노렐빈이 포함된 배지 500μL를 웰 C3 및 C4에 추가합니다.
5. 고정 30분 전에 컬럼 2의 웰을 5μL의 시클로헥시미드(1mg/mL 스톡)로 처리하고 컬럼 4의 웰을 2μL의 퓨로마이신(1.25mg/mL 스톡)으로 처리합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣기 전에 플레이트를 부드럽게 흔들어 섞습니다.

3. 세포 고정 및 면역형광

참고: 실험 전에 메탄올이 -20°C로 냉각되었는지 확인하십시오. PBS(Phosphate-buffered Saline), PBS의 5% NHS(Normal Horse Serum), PBS의 4% PFA(Paraformaldehyde)를 포함한 완충액을 만듭니다.

1. 매체를 버리고 커버 슬립이 들어있는 웰을 PBS로 씻으십시오. 사용하는 약물에 따라 배지 함유 약물을 적절하게 폐기하는 것이 중요할 수 있습니다. 구체적인 지침은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오. 효율적으로 세척하려면 스퀴즈 병에 PBS를 채우고 팽팽한 흐름이 아닌 부드러운 흐름을 허용하도록 팁을 잘라 원래 PBS를 흡인 후 각 웰에 PBS를 추가하는 데 사용합니다.
2. 실온에서 15분 동안 ~250μL의 4% PFA를 사용하여 세포를 고정하고 부드러운 교반으로 RT합니다. 커버슬립 상단을 PFA로 완전히 덮습니다. 250μL이면 충분하지만 그렇지 않은 경우 더 추가하십시오. 일부 세포(또는 세포의 스트레스 처리)는 부착을 변경할 수 있으며 피펫팅의 힘으로 세포가 분리될 수 있으므로 항상 커버슬립에 직접 피
펫팅을 피하십시오.
3. PFA를 제거하고 올바르게 폐기하십시오. 파라포름알데히드를 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오.
4. 메탄올 (- 20 °C)의 ~250 μL를 추가하고 온화한 흔들기의 밑에 RT에 5 분 동안 잠복하십시오; 이것은 세포를 투과시키고 평평하게 합니다.
5. 메탄올을 제거 및 폐기하고 4°C에서 하룻밤 동안 O/N으로 RT에서 1시간 동안 5% NHS의 ~250μL를 적용하여 세포를 차단합니다. 메탄올을 올바르게 폐기하는 방법에 대한 자세한 내용은 지역 환경 안전 사무소에 문의하십시오.
6. 1차 항체의 경우 항체를 5% NHS.
   로 희석합니다. 메모: 여러 SG 마커를 사용하는 것은 관찰된 과립이 실제 SG인지 여부를 확인하는 데 중요합니다. 사용할 수 있는 SG 마커의 수는 현미경에서 사용할 수 있는 필터에 따라 다릅니다. 표준 녹색, 적색 및 원적외선 필터 세트를 사용할 수 있는 경우 1/250 희석에서 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 사용합니다.
   1. 이 실험(각각 250μL에서 12개의 커버슬립-총계: 5% NHS 3mL)의 경우 항-G3BP1, 항-eIF3b 및 항-eIF4G 각각을 12μL씩 추가합니다. RT에서 최소 1시간 동안 또는 4°C에서 O/N으로 부드러운 교반을 사용하여 1차 항체를 배양합니다.
7. PBS로 웰을 3번 세척하고 각 세척을 5분 동안 배양합니다.
8. 2차 항체의 경우 모든 2차 항체(1/250 희석)와 Hoechst 염료(1/1,000 희석)를 5% NHS에 희석합니다.
   1. 이 실험(각 250μL에서 12개의 커버슬립-합계: 5% NHS 3mL)의 경우 Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit 및 Cy5-Goat(각각 1/250 희석)를 각각 12μL씩 추가하고 3μL의 Hoechst 염료를 추가합니다.
   2. RT에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 커버슬립을 배양합니다. 이 단계와 다음 단계를 수행하는 동안 플레이트를 상자로 덮거나 조직 배양 접시 위에 호일을 올려 빛으로부터 샘플을 보호합니다.
9. PBS로 우물을 각각 5분 동안 세 번 씻습니다.
10. 장착 매체를 사용하여 라벨이 붙은 유리 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 37°C 가열 블록에서 장착 매체를 10분 동안 가열합니다. 이렇게 하면 점도가 감소하고 피펫팅이 더 쉬워집니다. 절단된 P200 팁을 사용하여 커버슬립당 25μL의 장착 매체를 유리 슬라이드에 피펫으로 고정합니다. 4-8개의 커버슬립은 현미경 스테이지가 이를 허용한다고 가정할 때 하나의 유리 슬라이드에 들어갈 수 있습니다. 가는 집게를 사용하여 커버슬립을 웰에서 슬라이드로 옮기고 셀 쪽이 장착 매체에 아래로 향하도록 합니다. 깨끗한 P200 팁을 사용하여 커버슬립을 아래로 누릅니다.
11. 모든 커버슬립이 장착되면 접힌 실험실 티슈를 사용하여 실험실 티슈를 슬라이드에 매우 단단히 눌러 과도한 장착 매체를 청소합니다. H₂O가 들어있는 스퀴즈 병을 사용하여 여분의 장착 매체를 씻어 낸 다음 접힌 실험실 조직으로 블로팅을 반복하여 물을 제거합니다.

결과

그림 1: 실험 다이어그램.(A) 표시된 대로 이전에 24웰 플레이트에 배치된 커버슬립에 종세포를 주입합니다. 표시된 대로 μM 단위의 농도를 사용하여 SA 또는 VRB로 A열과 B열을 60분 동안 처리합니다. 60분 후 약물 함유 배지에 CHX(최종 농도: 컬럼 2의 경우 20μg/mL) 또는 퓨로(컬럼 4의 경우 20μg/mL 퓨로마이신)를 첨가합니다. 고정 및 염색 전에 추가로 30분 동안 배양을 계속합니다. (B) 계수를 위해 이미지화해야 하는 필드를 나타내는 커버슬립 다이어그램. 커버슬립은 대략 동일한 5개의 영역으로 나뉩니다. 각 지역에서 하나의 이미지가 촬영됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
U-2 OS	증권 시세	ATCC®HTB-96™	- 일반적으로 "U2OS" 로 표기 - 37°C에서 10% FBS/DMEM의 5% CO2 이하에서 배양
둘베코의 독수리 매체 변형	코 닝	10-013-이력서	- 약칭 DMEM - 포도당, 피루베이트, 페놀 레드 4.5g/L 함유 - 10% FBS, 10mM HEPES 및 페니실린/스텝토마이신 보충 - 이전 약물 희석 예열 - 사전 예열 이전 약물 희석
소 태아 세럼	시그마	F2442-500ml	- 약칭 FBS - 배지를 보충하는 데 사용됩니다
헤페스 (1M)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15630-080	- 배지를 보충하는 데 사용됩니다
페니실린 스트렙토마이신	시그마	P0781-100ml	- 배지를 보충하는 데 사용됩니다
24웰 플레이트	코스타	3524
실험실 조직	(주)킴텍사이언스	34120	- 일반적으로 "Kimwipes"라고 합니다.
성장 커버 안경용 커버 글라스	피셔 사이언티픽	제12-545-82	- 사용 전 오토클레이브 - 조직 배양 후드에서 멸균 상태 유지
나트륨 (메타) 비소 ≥90 %	시그마	S7400-100G	- 일반적으로 비소나트륨이라고 하며 약칭 SA - 1M 농도로 물에 용해 한 다음 작업 원료로 100μM로 희석합니다.
비노렐빈	TSZ 켐	RS055	- 약칭 VRB - 10mM까지 물에 용해
푸로마이신	시그마	P9620	- 번역 수준(리보푸로마이실화)을 평가하는 데 사용됩니다 - 활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용됩니다. - 물에 10mg/mL로 희석
에메틴 디하이드로클로라이드 하이드레이트	시그마	E2375	- 일반 번역 수준을 평가하기 위해 Puro 와 함께 사용됩니다. - 활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용됩니다. - 물에 10mg/mL로 희석
시클로헥시미드	시그마	C4859	- CHX 약칭 - 활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용됩니다. - 물에 10mg/mL로 희석
인산염 완충 식염수	론자 / VWR	95042-486	- 약칭 PBS - 면역형광을 위한 세척 완충액
파라포름알데히드 시약 등급, 결정질	시그마	P6148-500G	- 흄 후드의 뜨거운 PBS에 4% 용액을 만들고 용해될 때까지 저어줍니다 - 부분 표본은 -20 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다 - 위험한, 환기 사용 - 특수 쓰레기에 버리십시오
메탄올, ACS	증권 시세 표시기 / 폭스바겐	BDH1135-4LP	- 사용하기 전에 -20°C로 사전 냉각 - 특수 쓰레기에 버리십시오
노멀 호스 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31874	- 약칭 NHS - PBS 에서 5%로 희석 - 4°C 에서 보관하기 위해 아지드화나트륨을 첨가합니다. - 면역형광을 위한 차단 용액
에탄올, 순수, 200 프루프 (100%), USP, KOPTEC	데콘 연구소 / VWR	89125-188	- 물로 70%까지 희석
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드	피셔브랜드	제12-550-15
마우스 anti G3BP1 항체 (TT-Y)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-81940	- 4 °C 에서 보관하십시오. - 1/100 희석액에서 사용
토끼 anti eIF4G 항체 (H-300)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-11373	- 4 °C 에서 보관하십시오. - 1/250 희석
Goat anti eIF3η (N-20) 항체	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-16377	- eIF3η는 eIF3b 라고도 합니다. - 4 °C 에서 보관 - 1/250 희석
Cy2 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L)	잭슨 면역 연구	전화: 715-225-150	- 제조업체의 지침에 따라 물에 재구성한 다음 4°C 에서 보관하십시오. - 1/250 희석
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)	잭슨 면역 연구	전화: 711-165-152	- 제조업체의 지침에 따라 물에 재구성한 다음 4°C 에서 보관하십시오. - 1/2500 희석
Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 염소 IgG (H+L)	잭슨 면역 연구	Tel.: 705-175-147	- 제조업체의 지침에 따라 물에 재구성한 다음 4°C 에서 보관하십시오. - 1/250 희석
Hoechst 33258 솔루션	시그마	94403-1ML	- 2 차 항체로 배양 - dH20에서 0.5 mg / mL 저장 용액, 빛으로부터 보호 - 4 °C에서 보관
20 x SSC 버퍼	써모 피셔 앰비온	AM9763	- RNase Free water(DEPC 처리)를 사용하여 2X SSC로 희석- 실온 보관 - FISH용 세척 버퍼
슬라이드 장착 매체	집에서 만든	/	- PBS 20ml에 "냉용성"폴리 (비닐 알코올) 5g을 혼합하십시오.- 초음파 처리로 혼합, RT-글리세롤 5ml와 20 % 아지드 나트륨 0.2ml를 첨가하고 RT-원심 분리에서 16 시간 동안 교반-20 분 동안 20,000g에서 원심 분리, 큰 펠릿 부분 표본 점성 액체를 버리고, -20°C에서 장기 보관, 4°C에서 1주일
파라필름 "M"	시그마	P7793-1개	- 일반적으로 "파라필름"이라고 합니다.
폴리(비닐 알코올)	시그마	P-8136-250G	- 비놀을 만들기 위한 시약
글리세롤	시그마	G5516-100ML	- 비놀을 만들기 위한 시약
아지드화나트륨	피셔 사이언티픽	에스2002-5G	- 차단액 및 vinol 용 방부제 - 물에 20% 희석합니다.

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