An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes(과립구 및 단핵구에서 식세포작용 및 산화 버스트 활성을 평가하기 위한 분석)

초록

출처: Meaney, M. P. et al., 인간 혈액에서 과립구 및 단핵구 식세포 작용 및 산화 폭발 활성 측정. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 유세포 분석을 통해 인간 혈액 내 세포의 식세포 활성을 확인하는 분석을 보여줍니다. 과립구와 단핵구는 각각 포위된 박테리아의 존재와 산화 폭발 활성을 확인하는 녹색과 적색 형광을 보여줌으로써 식세포 활성을 확인합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 분석 준비

1. 절차에 지정된 자료를 수집, 준비 및 구성합니다(특정 재료/장비 표 참조).
   1. 12 x 75mm 튜브에 라벨을 붙입니다.
      1. 각 참가자에 대해 두 개의 튜브에 라벨을 붙입니다: 식세포작용 분석을 위한 튜브 1개(이 튜브를 검정 잉크로 표시하고 플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC]의 경우 "F"로 표시)와 산화 버스트(OB) 활성 분석을 위한 튜브 1개(이 튜브에 빨간색 잉크와 디하이드로에티듐[HE]의 경우 "H"로 표시).
         메모: 의도하지 않은 세포 활성화 및 관련 배경 소음 증가를 최소화하기 위해 멸균 12 x 75mm 튜브를 사용하는 것이 좋습니다.
      2. 분석 대조군을 위한 튜브 3개: 식세포작용 분석용 튜브 1개(FITC 대조군: 이 튜브에 검정 잉크와 "F" 표시), OB 활성 분석용 튜브 1개(HE 대조군: 이 튜브에 빨간색 잉크와 "H" 표시), 음성 대조군용 튜브 1개(혈액만: 이 튜브에 녹색 잉크와 "혈액만"으로 표시).
   2. 분석 당일 최소 하루 전에 원액을 준비합니다.
      1. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 10x PBS 100ml를 18.2MΩ H₂O 900ml로 희석합니다. 필터는 0.2μm 필터로 살균합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
      2. 멸균 PBS 포도당을 준비합니다. PBS 100ml에 포도당 1.0g을 녹입니다. 필터는 0.2μm 필터로 살균합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
      3. 멸균 0.1M 구연산염 완충액을 준비합니다. 18.2MΩ H₂O 100ml에 구연산 1.2g과 구연산나트륨 1.1g을 용해시킵니다.pH를 4.0으로 조정합니다. 필터는 0.2μm 필터로 살균합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
      4. HE 원액을 준비합니다. 1.0ml의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 HE 1.0mg을 재현탁합니다. 부드럽게 섞고 분취량으로 섭취한 후 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
      5. FITC 표지된 황색포도상구균(S. aureus) 원액(2 x 10⁹ particles/ml)을 준비합니다. FITC가 표지된 황색포도상구균 10mg을 PBS 1.5ml(또는 적당량)에 재현탁합니다. 3개의 500μl 분취량으로 나누고 제조업체의 권장 사항에 따라 초음파 처리합니다. 분취제는 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
      6. 표지되지 않은 S. aureus 원액(2 x 10⁹ particles/ml)을 준비합니다. 표지되지 않은 황색포도상구균 100mg을 PBS 15ml(또는 적당량)에 재현탁합니다. 30개의 500 μl 분취량으로 나누고 제조업체의 권장 사항에 따라 초음파 처리합니다. 분취제는 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
   3. 분석 당일에 새로운 작업 용액을 준비하십시오.
      1. HE 작업 솔루션을 준비합니다. 10μl의 해동된 HE 원액을 990μl의 PBS-포도당으로 옮깁니다. 빛을 피하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
      2. FITC 표지된 S. aureus 작업 용액(133,333 particles/μl)을 준비합니다. 70μl의 해동된 FITC 표지 S. aureus 스톡 용액을 980μl의 PBS로 옮깁니다. 빛을 피하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
      3. 표지되지 않은 S. aureus 작업 용액(133,333 particles/μl)을 준비합니다. 70μl의 해동된 표지되지 않은 S. aureus 원액을 980μl의 PBS로 옮깁니다. 빛을 피하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
      4. 담금질 용액을 준비합니다. 750μl의 0.4% 트리판 블루 용액을 11.25ml의 멸균 0.1M 시트레이트 완충액에 추가합니다. 사용할 때까지 얼음물 욕조에 보관하십시오.
   4. 공인된 정맥 의사가 세계보건기구(WHO)의 채혈 지침에 따라 채혈하도록 합니다.
      1. 디포타슘 에틸렌디아민테트라아세트산(K₂EDTA)이 들어 있는 4ml 채혈 튜브 하나에 혈액을 채취합니다. 제조업체의 지침에 따라 채혈 튜브를 뒤집습니다. 채혈 튜브를 사용할 때까지 벤치탑 로커에서 실온에 보관하십시오. 1.2.1단계에 설명된 백혈구(WBC)를 사용한 전체 혈구 수(CBC) 감별 분석에 이 혈액을 사용합니다.
      2. 리튬 헤파린이 들어 있는 4ml 채혈 튜브 하나에 혈액을 채취합니다. 제조업체의 지침에 따라 채혈 튜브를 뒤집습니다. 사용할 때까지 채혈 튜브를 벤치탑 로커에서 실온(RT)으로 유지하십시오. 이 혈액을 2단계에서 설명한 단핵구 및 과립구 식세포작용 및 OB 활성 분석에 사용합니다.
2. 각 샘플에 대한 분석을 완료하는 데 필요한 박테리아(즉, S. aureus)의 양을 결정합니다.
   1. 혈액학 분석기를 사용하여 제조업체의 지침에 설명된 대로 혈액에 대한 WBC 감별 분석을 포함한 CBC를 수행합니다. WBC 수(단위: cells/ml), %Neutrophil 및 %Monocyte 값을 기록해 둡니다.
   2. 아래 방정식을 사용하여 각 샘플에 대한 호중구 및 단핵구 수를 확인하십시오.
      호중구 수(세포/ml 단위) = %호중구 × WBC(세포/ml 단위)
      단핵구 수(단위: cells/ml) = %단핵구 × WBC(단위: 세포/ml)
   3. 아래 방정식을 사용하여 각 샘플에 대한 식세포 수와 샘플의 100μl에 존재하는 식세포 수를 결정합니다.
      식세포 수(세포/ml) = 호중구 수(세포/ml) + 단핵구 수(세포/ml)
      100 μl의 식세포 수 = (식세포 수(세포/ml))/10
   4. 아래 방정식을 사용하여 각 샘플에 필요한 박테리아(즉, S. aureus)의 수와 각 튜브에 추가해야 하는 FITC 표지 S. aureus 또는 표지되지 않은 S. aureus 작업 용액의 양(133,333 particles/ml)을 결정합니다.
      메모: 표적 박테리아 : 식세포 비율은 8 : 1.
      입니다. 필요한 박테리아 수 = 100μl의 식세포 수 × 8
      필요한 FITC 또는 라벨링되지 않은 작업 용액의 부피(μl) = (필요한 박테리아 수)/(133,333 입자/μl)

2. 분석 수행

1. 분석을 위해 전혈을 준비합니다.
   1. 각 참가자와 대조 튜브에 대해 길이가 확장된 피펫 팁을 사용하여 리튬 헤파린 채혈 튜브에서 적절하게 라벨링된 12 x 75mm 튜브의 바닥으로 100μl의 전혈을 전달합니다. caps.
      바꾸기 메모: 12 x 75mm 튜브의 측면에 혈액이 묻지 않도록 주의하십시오.
   2. 마이크로피펫을 사용하여 HE control tube를 포함하여 빨간색 잉크와 "H"로 표시된 튜브에 10μl의 HE 작업 용액을 추가합니다. 캡과 와류를 잠시 교체하십시오.
   3. 모든 튜브를 37°C 수조에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 즉시 모든 튜브를 얼음물 수조에 12분 동안 옮깁니다.
      메모: 열린 금속 랙을 사용하고 5분마다 랙을 부드럽게 흔들어 튜브가 빠르고 적절하게 예열 또는 냉각되도록 합니다.
2. 박테리아(즉, S. aureus)를 샘플과 대조 튜브에 추가합니다.
   1. 마이크로피펫을 사용하여 적절한 양(1.2.4단계에서 계산)의 표지되지 않은 S. aureus 작업 용액을 HE 제어 튜브를 포함하여 빨간색 잉크와 "H"로 표시된 튜브에 추가합니다. 캡과 와류를 잠시 교체하십시오.
   2. 마이크로피펫을 사용하여 FITC 조절 튜브를 포함하여 검은색 잉크와 "F"로 표시된 튜브에 적절한 양(1.2.4단계에서 계산)의 FITC 표지 S. aureus 작업 용액을 추가합니다. 캡과 와류를 잠시 교체하십시오.
   3. "혈액 전용" 제어 튜브를 소용돌이치되 두 유형의 박테리아(즉, S. aureus)를 추가하지 마십시오.
   4. 모든 튜브를 37°C 수조에서 20분 동안 배양합니다. 열린 금속 랙을 사용하고 5분마다 랙을 부드럽게 흔들어 튜브가 빠르고 적절하게 예열되도록 합니다. 잠복기가 끝나면 즉시 모든 튜브를 얼음물 수조에 1분 동안 옮깁니다.
3. 세포를 씻으십시오.
   1. 리피터 피펫을 사용하여 모든 튜브에 100μl의 얼음처럼 차가운 담금질 용액을 추가합니다. 뚜껑을 교체하고 잠시 와류를 일으킨 다음 모든 튜브를 얼음 위에서 1분 동안 배양합니다.
   2. 리피터 피펫을 사용하여 모든 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 추가합니다. Vortex를 간단히 사용한 다음 모든 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 2ml를 추가하고 캡을 교체합니다. 모든 튜브를 4°C 및 270 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡입합니다.
   3. 2.3.2단계를 한 번 반복합니다(총 2회 세탁).
4. 유세포 분석을 위한 시료를 준비합니다.
   1. 리피터 피펫을 사용하여 얼음처럼 차가운 소 태아 혈청 50μl를 모든 튜브에 추가합니다. 모든 튜브를 간단히 와류로 만듭니다.
   2. 모든 튜브를 적절한 캐러셀로 옮기고 적혈구(RBC) 용해 및 WBC 고정 시약이 있는 자동 세포 용해효소 준비 워크스테이션을 사용하여 적혈구를 용해하고 제조업체의 지침에 설명된 대로 WBC를 고정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12 x 75 mm 튜브, 캡 포함	폭스바겐	20170-579	샘플당 2개의 튜브("H" 및 "F")와 배치당 3개의 튜브(분석 대조군의 경우, "F", "H" 및 "혈액만")가 필요합니다.
PBS(10배), pH 7.4	생명 기술	70011-044
보틀 탑 0.2μm 셀룰로오스 아세테이트 필터(500ml 용량)	피셔 사이언티픽	09-741-07
포도당, 분말	생명 기술	제15023-021
구연산(무수, 세포 배양 테스트, 식물 세포 배양 테스트)	시그마-알드리치	C2404-100G
구연산나트륨 tribasic dihydrate	시그마-알드리치	에스4641-25G
디하이드로에티듐 (하이드로에티딘) (HE)	생명 기술	D11347
디메틸 설폭사이드(DMSO) 무수	생명 기술	D12345
황색포도상구균(단백질 A가 없는 목재 균주) 생물입자, 플루오레세인 접합체(FITC)	생명 기술	S2851
황색포도상구균(단백질 A가 없는 목재 균주) 표지되지 않은 생체 입자	생명 기술	에스-2859
트리판 블루 솔루션, 0.4%	생명 기술	제15250-061
7.2mg K2EDTA를 함유한 4.0mL 진공 청소기, 분무 건조	폭스바겐	BD367861	검체당 1개의 K2 EDTA 채혈 튜브가 필요합니다.
68 USP 단위의 리튬 헤파린을 함유한 4.0mL 진공 포장기, 스프레이 코팅	폭스바겐	BD367884	샘플당 1개의 리튬 헤파린 채혈 튜브가 필요합니다.
쿨터 Ac·T 5diff CP	벡크만 쿨터	6605705	즉, 혈액학 분석기
COULTER Ac·T 5diff 린스	벡크만 쿨터	8547167
COULTER Ac·T 5diff 수정	벡크만 쿨터	8547171
쿨터 Ac·T 5diff WBC Lyse	벡크만 쿨터	8547170
쿨터 Ac·T 5diff Hgb Lyse	벡크만 쿨터	8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal 캘리브레이터	벡크만 쿨터	7547175
COULTER Ac·T 5diff 컨트롤 플러스	벡크만 쿨터	7547198
AcT 5diff 희석제	벡크만 쿨터	8547169
200 μL 확장 길이 피펫 팁	폭스바겐	37001-526
단열 얼음 팬	폭스바겐	89198-980	얼음물 목욕용.
개방형 금속 튜브 랙	폭스바겐	60916-702
소 태아 세럼	생명 기술	제26140-111
TQ-Prep 워크스테이션	벡크만 쿨터	6605429	즉, 자동화된 Cell Lyse 준비 워크스테이션
ImmunoPrep 시약 시스템	벡크만 쿨터	7546999	즉, RBC lyse/WBC fix 시약 시스템
쿨터 클렌츠	벡크만 쿨터	8546929

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