Quantification of immune mediaator levels in human mucosal lining fluid(인간 점막 내막액의 면역 매개체 수치 정량화)

초록

출처: Wolsk, H. M. et al., 생체 내 상부 기도 면역 매개체 수준의 정량화를 위한 점막 내벽액의 비침습적 샘플링.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 신생아 인간 비강 점막 내막 유체 추출물의 면역 매개체 수치를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 전기화학발광 기반 멀티플렉스 분석 시스템은 매개체가 여기될 때 방출되는 빛의 강도를 평가하여 이러한 매개체를 측정합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 실험적 설정

1. 여과지 시트(섬유질 수산화폴리에스테르 시트, 재료표 참조)를 사용합니다.
   1. 생후 1개월 된 아이의 경우 3 x 15mm 크기, 나이가 많은 어린이와 성인의 경우 L자형(5 x 20 x 10mm(L의 짧은 팔))을 잘라냅니다.
2. 집게를 사용하여 유아의 양쪽 콧구멍에 여과지 한 장을 삽입합니다. 여과지를 하부 비갑개의 앞쪽 부분에 놓습니다(신생아의 경우 콧구멍 안쪽 약 1cm, 다른 모든 연령의 경우 1.5cm).
   1. 신생아를 침대에 눕히고 설탕물을 주어 편안함을 느끼게 해주세요.
      메모: 다른 모든 연령대의 어린이의 경우, 표본 추출은 피험자가 의자에 앉을 때 가장 쉽게 수행됩니다.
   2. 나이가 많은 어린이의 경우 L자형 여과지의 긴 팔을 각 콧구멍에 삽입하십시오.
3. 콧구멍 주위에 코 클립을 적용하여 불편함을 최소화하고 여과지가 우발적으로 손실되는 것을 방지하십시오.
4. 흡수 2분 후 여과지를 제거합니다.
5. 라벨이 붙은 튜브에 여과지를 넣고 즉시 -80°C에서 동결합니다.
6. 샘플링 당일에 아이가 보인 기도 감염 증상을 기록해 두십시오.
7. 샘플링 2분 동안 발생하는 재채기, 지속적인 울음 또는 비명주성을 기록합니다.

2. 기도 면역 매개체의 정량화

1. 냉동실에서 최대 10개의 무작위 샘플을 채취합니다. 식별 번호를 기록합니다. 전체 작업 과정에서 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 얼음에서 해동한 후, 양쪽 콧구멍의 여과지(개체당)를 완충액 25mL당 완전한 프로테아제 억제제 정제 1정(재료표 참조)이 들어 있는 새로 준비된 완충액 300μL(재료표 참조)에 담급니다.
   1. 여과지의 크기에 따라 버퍼의 부피를 조정하십시오.
      1. 3 x 15mm 크기의 여과지에는 300μL의 버퍼를 사용합니다.
      2. 여과지가 하나뿐인 경우 버퍼 부피(150μL)의 절반을 사용합니다.
3. 샘플을 플레이트 셰이커(400rpm)에 5분 동안 넣고 타이머를 사용합니다.
4. 촉촉한 여과지와 분석 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브 내에 있는 셀룰로오스 아세테이트 튜브 필터(0.22μm 공극 크기) 컵으로 옮깁니다(재료 표 참조).
5. 냉각된 원심분리기(4°C)에서 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 튜브에서 여과된 비강 추출물을 얻습니다.
6. 컵을 제거하고 튜브를 얼음 위에 유지하면서 비강 추출물을 저단백질 결합 저장 플레이트의 웰에 분취합니다(재료 표 참조).
7. 분석할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
8. 고감도, 전기화학발광 기반 다중화 어레이 시스템을 사용하여 비강 추출물의 사이토카인 및 케모카인 농도를 측정합니다(재료 표 참조).
   씨: 인간 10-plex_{TH 1}/_TH2사이토카인 분석, 9-플렉스 케모카인 분석, 단일 플렉스 인터루킨-17A(IL-17A), 형질전환 성장 인자-베타1(TGF-β1) 및 흉선 기질 림프포포이에틴(TSLP)을 여기에서 수행했습니다.
   1. 분석을 위해 4°C에서 밤새 비강 추출물을 배양하고 표준 제조업체 프로토콜에 따라 측정을 수행합니다(재료 표 참조).
      메모: 면역 분석(재료 표 참조)은 일반적으로 1 - 10,000 pg/mL 범위의 측정 동적 범위를 갖지만 일부 분석의 경우 100,000 pg/mL일 수 있습니다. 이는 모든 샘플이 동일한 희석으로 실행될 수 있음을 의미하며, 따라서 다른 유사한 면역 분석의 경우와 마찬가지로 건강한 피험자와 질병이 있는 피험자에 대한 서로 다른 희석의 영향을 제한할 수 있습니다. 모든 사이토카인에 대한 검출 하한은 1 pg/mL 이하였으며, 케모카인의 경우 1 - 50 pg/mL 사이였습니다. TSLP는 생후 1개월에 샘플의 98%에서 검출되지 않았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
섬유질 하이드록실레이티에스테르 시트	아큐윅 울트라	SPR0730	여과지
Milliplex 분석 버퍼	밀리포어	엘-AB	완충기
저단백질 결합 보관 플레이트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	CLS8161	격판덮개
프로테아제 억제제	로슈	11873580001	완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일
다중 스폿 플레이트 리더	중간 규모	해당 없음	섹터 이미저 6000
어세이	중간 규모		인간 10-plex TH1/TH2 사이토카인 분석 및 9-plex 케모카인 분석, 싱글플렉스 IL-17A, TGF-β1 및 TSLP. 설명은 www.mesoscale.com 에서 온라인으로 찾을 수 있습니다.

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