프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

Abstract

출처: Jaimes, J. A., et al. 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석: 코로나바이러스 스파이크 단백질 활성화에 대한 응용. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 형광 펩타이드를 사용하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 프로테아제는 펩타이드의 절단 부위를 인식하여 절단하고 형광단에서 소광체를 분리하여 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 검출하고 분석하여 다양한 펩타이드 변이체의 분할 효율을 확인합니다.

Protocol

1. 펩타이드 설계 및 준비

1. NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 또는 바이러스 병원체 데이터베이스(https://www.viprbrc.org)와 같은 공개 데이터베이스에서 관심 융합 단백질의 염기서열을 획득합니다. 융합 펩타이드 이전의 프로테아제 인식 부위를 선택하고 이 염기서열의 업스트림 및 다운스트림에 2-3개의 아미노산을 포함합니다.
2. 펩티드를 주문할 때 N-말단에서 FRET 쌍 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl(MCA)로 수정하고 C-terminus.
   에서 N-2,4-dinitrophenyl(DNP)을 수정합니다. 메모: 여러 공급업체가 이러한 수정 사항을 제공합니다. 가격과 배송 시간은 선택한 공급업체에 따라 다릅니다. 그러나 감도가 다양하고 파장 측면에서 플레이트 리더의 조정이 필요한 대체 변형이 존재합니다.
3. 제조업체의 권장 사항에 따라 펩타이드를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 예를 들어, 70% 에탄올의 펩타이드를 최종 농도 1mM까지 재현탁합니다.
4. 선택적으로, 펩타이드가 피펫팅에 의해 잘 재현탁되지 않는 경우 완전히 재현탁될 때까지 펩타이드와 용매를 포함하는 튜브를 초음....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
펩 티 드	바이오 매틱	해당 사항 없음
후린	넵	P8077S는
트립신, TPCK 처리	시그마-알드리치	4352157-1KT
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
염화나트륨2	시그마-알드리치	C1016
2-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M6250
트리톤-X100	시그마-알드리치	엑스100
PBS (PBS)	코 닝	21-040-이력서
스펙트라맥스 제미니 XPS	분자 장치	엑스프스
소프트맥스 프로 6.5.1	분자 장치	해당 사항 없음
96웰 플레이트(바닥이 평평하고 처리되지 않은 단단한 검은색 폴리스티렌)	코스타	3915
광 댐핑 튜브	왓슨 랩	131-915BL 또는 131-915BR