프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석

초록

출처: Jaimes, J. A., et al. 단백질 분해 활성을 스크리닝하기 위한 형광 펩타이드 절단 분석: 코로나바이러스 스파이크 단백질 활성화에 대한 응용. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 형광 펩타이드를 사용하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 프로테아제는 펩타이드의 절단 부위를 인식하여 절단하고 형광단에서 소광체를 분리하여 형광 방출을 가능하게 합니다. 형광 신호를 검출하고 분석하여 다양한 펩타이드 변이체의 분할 효율을 확인합니다.

프로토콜

1. 펩타이드 설계 및 준비

1. NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 또는 바이러스 병원체 데이터베이스(https://www.viprbrc.org)와 같은 공개 데이터베이스에서 관심 융합 단백질의 염기서열을 획득합니다. 융합 펩타이드 이전의 프로테아제 인식 부위를 선택하고 이 염기서열의 업스트림 및 다운스트림에 2-3개의 아미노산을 포함합니다.
2. 펩티드를 주문할 때 N-말단에서 FRET 쌍 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl(MCA)로 수정하고 C-terminus.
   에서 N-2,4-dinitrophenyl(DNP)을 수정합니다. 메모: 여러 공급업체가 이러한 수정 사항을 제공합니다. 가격과 배송 시간은 선택한 공급업체에 따라 다릅니다. 그러나 감도가 다양하고 파장 측면에서 플레이트 리더의 조정이 필요한 대체 변형이 존재합니다.
3. 제조업체의 권장 사항에 따라 펩타이드를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 현탁시킵니다. 예를 들어, 70% 에탄올의 펩타이드를 최종 농도 1mM까지 재현탁합니다.
4. 선택적으로, 펩타이드가 피펫팅에 의해 잘 재현탁되지 않는 경우 완전히 재현탁될 때까지 펩타이드와 용매를 포함하는 튜브를 초음파 처리 수조에 추가합니다.
5. 펩타이드를 빛을 흡수하는 튜브 또는 저항성 튜브로 분취하여 펩타이드가 표백되는 것을 방지합니다. 여러 번의 동결/해동 주기(예: 100μL)를 피하기 위해 부분 표본 크기를 작게 유지합니다. 부분 표본은 -20°C에서 보관하십시오.

2. 형광판 리더 준비

1. 플레이트 리더를 켜고 자체 테스트가 완료될 때까지 기다립니다.
2. 연결된 컴퓨터에서 작동 소프트웨어를 열고 플레이트 리더기에 연결되어 있는지 확인하십시오.
3. 온도 설정을 열고 30°C(또는 프로테아제의 최적 성능에 필요한 온도)로 설정합니다.
4. Control(제어) | 기기 설정을 클릭하여 실험을 설정합니다.
5. Kinetic을 선택합니다.
6. 형광을 선택합니다.
7. 여기 및 방출 파장을 각각 330nm 및 390nm로 입력합니다.
8. 자동 절단을 선택 취소합니다.
9. 중간, 보통 감도를 선택합니다.
10. 분석에 대해 1시간의 런타임을 선택하고 60초마다 하나의 측정을 선택합니다.
11. 첫 번째 측정 전에 5초 혼합을 설정하고 각 측정 3초 전에 혼합을 설정합니다
12. 판독할 웰을 선택하고 분석을 시작합니다.

3. 분석 준비

1. 각 성분에 대한 적절한 양을 계산하고 추가하여 분석 버퍼를 준비합니다. 퓨린의 경우, 100 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 1 mM 2-메르캅토에탄올 및 5% 트리톤 X-100으로 구성된 완충액을 만듭니다. 트립신의 경우 표준 인산염 완충 식염수(PBS) 용액을 사용합니다.
   메모: 10mL 이하의 부피로 충분합니다. 분석에 사용된 프로테아제에 따라 완충액이 달라집니다.
2. 얼음으로 버퍼를 식히십시오.
3. 냉각 및 안정성을 지원하기 위해 아래에 얇은 금속판이 있는 얼음 위에 분석 플레이트를 놓습니다. 바닥이 평평하고 처리되지 않은 단단한 검은색 폴리스티렌 96웰 플레이트를 사용합니다.
   메모: 인접한 우물에서 형광 "누출"을 방지하기 위해 검은색 플레이트를 사용하는 것이 필수적입니다.
4. 이전 간행물 또는 실험 데이터를 기반으로 각 반응에 추가할 적절한 단백질 분해 효소의 양을 계산합니다. 퓨린의 경우 0.5μL에 해당하는 반응당 1단위를 사용합니다. 트립신의 경우 0.5μL의 160nM TPCK 트립신을 사용합니다.
5. 샘플당 총 100μL 샘플에서 분석당 3개의 기술적 반복을 준비합니다.
   메모: 피펫팅이 정상적인 조명 조건에서 수행되는지 아니면 희미한 조명에서 수행되는지 여부에 차이가 없다는 것이 실험적으로 평가되었습니다. 그러나 펩타이드는 장기간 빛에 노출되어서는 안 됩니다.
6. 적절한 양의 분석 완충액(3.1단계에 설명된 대로 94.5μL)을 각 웰에 피펫팅합니다.
7. 각 웰에 프로테아제를 추가합니다. 퓨린과 TPCK 트립신 모두에 대해 샘플당 0.5μL를 사용합니다. 6웰(블랭크 대조군의 경우 3웰, 펩타이드 대조군의 경우 3웰)에 각각의 프로테아제 대신 0.5μL 완충액을 추가합니다.
8. 블랭크 대조군을 제외한 각 웰에서 최종 농도 50μM까지 펩타이드를 추가합니다. 이 경우, 피펫 5 μL 펩타이드를 단계 1.3에 기재된 바와 같이 제조하였다. peptide.
   대신 5μL의 완충액을 블랭크 대조군에 추가합니다. 메모: 펩티드의 여러 농도는 효소가 포화되었는지 확인하기 위해 처음에 설명된 효소 농도로 테스트되었습니다.
9. 플레이트를 형광 플레이트 리더에 삽입하고 시작을 클릭합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
펩 티 드	바이오 매틱	해당 사항 없음
후린	넵	P8077S는
트립신, TPCK 처리	시그마-알드리치	4352157-1KT
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
염화나트륨2	시그마-알드리치	C1016
2-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M6250
트리톤-X100	시그마-알드리치	엑스100
PBS (PBS)	코 닝	21-040-이력서
스펙트라맥스 제미니 XPS	분자 장치	엑스프스
소프트맥스 프로 6.5.1	분자 장치	해당 사항 없음
96웰 플레이트(바닥이 평평하고 처리되지 않은 단단한 검은색 폴리스티렌)	코스타	3915
광 댐핑 튜브	왓슨 랩	131-915BL 또는 131-915BR