기능화된 나노바디를 사용하여 GFP 표지된 표면 단백질이 골지횡단 네트워크에 도착하는 모니터링

초록

출처: Buser, D. P., et al. 배양된 세포에서 기능화된 나노바디를 사용하여 골지체 횡단 네트워크로의 내세포 흡수 및 역행 수송 분석. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 세포 내 이동 경로를 이해하기 위해 기능화된 나노바디의 흡수 및 역행 수송을 연구하는 방법을 보여줍니다. 방사선 표지된 황산염을 도입하고 분리 및 검출 기술을 활용함으로써 이 방법은 화물 단백질의 내포세포 흡수 및 트랜스 골지 네트워크 도착에 대한 연구를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. 배양 세포에 의한 기능성 나노바디의 흡수(황화 분석용)

1. 세포 배양 후드에서 35mm 접시 또는 항생제가 포함된 완전한 배지(Dulbecco의 Modified Eagle 배지, DMEM, 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 100 units/mL 스트렙토마이신, 2mM l-글루타민 및 1.5μg/mL 퓨로마이신이 보충됨).
   메모: 위에서 언급했듯이 여기서는 설명을 위해 EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 사용합니다. 안정한 세포주 외에도 일시적으로 transfection된 HeLa도 사용할 수 있습니다.
세포
2. O/N을 37°C에서 7.5% CO₂ 인큐베이터로 배양하여 증식합니다.
   메모: 세포는 다음 날 ~80%의 포화도를 가져야 합니다.
3. 전체 배지를 제거하고 RT에서 1x PBS로 2회 세척한 다음 7.5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 무황산염 배지(SFM)로 셀을 굶깁니다.
   메모: SFM은 MEM 아미노산 10mL(50x) 용액, L-글루타민(200mM) 5mL, 비타민 용액 5mL(100x) 및 CaCl₂·2H_2O900μL를 Eagle's balanced salt 500mL에 첨가하여 제조합니다. 0.22μm 필터와 부분 표본을 통과시킵니다.
4. 방사능 작업을 위해 지정된 환기 후드 또는 벤치에서 0.5mCi/mL[^35S] 황산염을 SFM.
   의 나트륨염으로 포함하는 황산염 라벨링 매체를 준비합니다. 주의: 방사능이 포함된 모든 용액을 조심스럽게 다루십시오. 지정된 후드 또는 벤치에서만 작업하십시오. 방사능과 접촉하는 모든 재료(팁, 튜브, 플레이트 등) 또는 세척 버퍼는 별도로 수거하여 폐기해야 합니다. 아래의 모든 단계(1.5-1.18단계)에 대해서도 이 작업을 수행합니다.
5. 1x PBS의 VHH-2xTS를 황산염 라벨링 배지에 최종 농도 2 μg/mL.
   로 추가합니다. 메모: 대조군으로, VHH-std 또는 TS 부위가 없는 다른 나노바디를 포함하여 특정 라벨링을 입증할 수도 있습니다.
6. SFM을 0.5 mCi/mL [35S]sulfate 및 2 μg/mL VHH-2xTS를 함유한 0.7 mL의 황산염 라벨링 배지로 교체하고 방사능 작업을 위해 지정된 7.5% CO₂ 인큐베이터에서 37 °C에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
   메모: 계획된 실험에 따라 나노바디 황산화 시간을 조정해야 합니다. 또한, TGN 도착 동역학을 결정하기 위해, 서로 다른 시간(예: 10분, 20분, 30분 등) 동안 라벨링을 수행합니다.
7. 라벨링 매체를 제거하고 냉각판 또는 얼음에서 얼음처럼 차가운 2x PBS로 셀을 3-1회 세척합니다.
8. 2mM PMSF 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 1mL의 용해 완충액(1% Triton X-100 및 0.5% 데옥시콜레이트를 함유한 PBS)을 추가하고 4°C의 흔들 플랫폼에서 10-15분 동안 세포를 배양합니다.
9. 용해물을 긁어서 1.5mL 튜브에 옮기고 용해물을 와류로 가열한 다음 4°C의 엔드 투 엔드 로테이터에 10-15분 동안 놓습니다.
10. 4°C에서 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리를 통해 핵 용해물을 준비합니다.
11. 새로운 1.5 mL 튜브를 사용하여 1.5 mL 튜브에 니켈 비드 슬러리 20-30 μL를 준비하고 1,000 x g에서 1 분 동안 부드럽게 펠릿화하여 1x PBS로 한 번 세척합니다 .
    메모: 니켈 비드 대신 스트렙타비딘 비드(나노바디가 비오틴화된 경우) 또는 나노바디의 에피토프(T7 또는 HA 태그)에 대해 IgG가 있는 단백질 A 비드를 사용할 수 있습니다.
12. 핵 후 용해물을 니켈 비드가 포함된 1.5mL 튜브로 옮기고 엔드-투-엔드 회전기에서 4°C에서 1시간 동안 배양하여 나노바디를 분리합니다. 핵 후 용해물의 분취액(50-100 μL)을 제거하고 SDS 샘플 완충액에서 끓여 총 세포 관련 나노바디, GFP 리포터 및 로딩 제어에 대한 후속 면역블롯 분석을 수행합니다.
13. 1,000 x g에서 1분 동안 부드럽게 펠릿화하여 1x PBS 또는 용해 버퍼로 비드를 3회 세척합니다.
    메모: 비드의 보다 엄격한 세척을 위해 20mM 이미다졸을 PBS 또는 용해 완충액에 포함할 수 있습니다.
14. 비드에서 모든 세척 버퍼를 조심스럽게 제거하고 50μL의 2x 샘플 버퍼를 추가한 다음 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
15. 끓인 두 비드를 midi 12.5% SDS-PAGE 젤에 로드하고 참조 염료(예: 브로모페놀 블루)가 분리 젤의 끝에 도달할 때까지 표준 PAGE 프로토콜에 따라 실행합니다.
    메모: 전체 세포 관련 나노바디, GFP 리포터 및 로딩 제어에 대한 면역블롯 분석은 미니 12.5% SDS-PAGE 또는 프리캐스트 그래디언트 겔을 사용하여 수행할 수도 있습니다.
16. RT에서 1시간 동안 ~30mL의 고정 완충액(ddH_2O의 10% 아세트산 및 45% 메탄올)에 분리 젤을 고정하고 ~50mL의 탈이온수로 겔을 세 번 세척한 다음 젤 건조를 준비합니다.
17. SDS-PAGE 젤 건조.​
    1. 늘어난 접착 필름에 고정 젤을 조심스럽게 놓고 미리 절단된 여과지로 덮습니다.
    2. 여과지가 아래로 향하게 한 젤을 건조 플랫폼 위에 놓고 진공 덮개를 놓고 젤 건조를 위해 진공 펌프를 켭니다. 젤을 3-5시간 동안 건조시킵니다.
    3. 접착 필름을 제거하고 건조된 젤을 형광체 스크린이 장착된 자가방사선 촬영 카세트에 넣습니다.
18. Phosphor Screen Imager를 사용한 이미지 자동 방사선 사진. 제조업체의 지침을 따르십시오.
    메모: 신호의 강도에 따라 건조된 겔은 형광체 스크린으로 더 오래 노출되어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-GFP 항체	시그마-알드리치	1.18145E+11	제품은 SigmaAldrich에서 유통하지만 Roche에서 제조합니다
Dulbecco의 변형 독수리 매체 (DMEM)	시그마-알드리치
송아지 태아 혈청(FCS)	바이오웨스트
황산나트륨으로서의 황-35	Hartmann 분석	ARS0105	제품에는 5mCi가 포함되어 있습니다
6웰 플레이트	증권 시세	92406
파라포름알데히드(PFA)	애플리켐	A3813
플루오로마운트-G	서던 바이오텍	제0100-01
미니 프로티언 TGX 겔, 4-20%, 15-웰	바이오 라드	456-1096

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