검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 기생충 문화
참고: 인간 병원체 취급에 대한 현지 규정을 따르십시오.
- 기생충 배양 배지에서 이전에 설명한 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 Plasmodium falciparum 기생충을 유지합니다(재료 표 참조).
- 앞서 설명한 대로 소르비톨 처리를 사용하여 기생충을 단단히 동기화된 상태로 유지합니다.
- Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구(IE) 표면에서 VAR2CSA 발현을 보장하기 위해 단백질 G-마그네틱 비드에 결합된 항VAR2CSA 항체(예: PAM1.4 항체, 교차 반응성 인간 단클론 VAR2CSA 특이적 IgG)를 사용하여 면역 자기 선택을 반복적으로 수행합니다.
- 간단히 말해서, 항VAR2CSA 항체에 결합된 마그네틱 비드로 후기 단계의 trophozoite-IE를 배양하고 자석을 사용하여 양성 선택합니다.
- 기생충혈증이 5% 이상이 될 때까지 몇 주기 동안 배양에서 선택한 기생충을 확장합니다.
- 또는 앞서 설명한 대로 플라스틱 고정 CSA(VAR2CSA의 수용체)에 결합하는 기생충을 선택합니다.
- 선택한 기생충에 대한 VAR2CSA 발현을 확인하기 위해 앞서 설명한 대로 유세포 분석을 수행합니다.
- 간단히 말해서, 후기 단계의 trophozoite-IEs를 자기 선택에 사용된 것과 동일한 항체(1.3단계)로 라벨링한 다음 형광 라벨링된 2차 항체로 라벨링합니다.
- 유세포 분석으로 IE 표면 반응도를 측정합니다. 성공적인 항체 선택은 일반적으로 대부분의 기생충에서 VAR2CSA 발현하는 기생충 집단(≈80%)을 초래합니다.
- phagocytosis assay의 경우 정제된 중기 및 후기 단계 trophozoite-IE를 사용합니다. 앞에서 설명한 대로 자기 분리를 사용하여 정제를 수행합니다.
메모: 기생충의 단계를 정확하게 결정하기 위해 혈액 도말에 Giemsa 염색을 수행한 후 광학 현미경 관찰을 수행합니다. 앞에서 설명한 대로 표준 절차와 형태학적 지침을 따릅니다. 후기 단계 정제는 밀도 구배 매체를 사용하여 수행할 수도 있습니다. 그러나 우리의 경험에 따르면 IE 수율은 더 낮으므로 자기 정제가 선호됩니다.
- 자기 분리를 위해 기생충 배양액(5-10% 기생충)을 실온에서 10분 동안 500 x g에서 회전시킵니다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 10mL의 기생충 배양 배지에 다시 현탁시킵니다.
- 기생충 현탁액을 Claricep Flash Silica에 넣고 CS 컬럼을 자석에 연결한 다음(재료 표 참조) 컬럼을 천천히 통과하도록 합니다. Trophozoite-IE는 상자성(hemozoin의 존재로 인해)이며 기둥 메쉬에 남아 있습니다.
- 50mL의 기생충 배양 배지로 컬럼을 세척하고 50mL의 기생충 배양 배지를 사용하여 마그네틱 컬럼에서 IE를 용리합니다.
- 1.5.3에서 500 x g의 용리액을 실온에서 10분 동안 돌립니다. 상등액을 조심스럽게 버리고 1mL의 기생충 배양 배지에 다시 현탁시킵니다.
- 혈구계를 사용하여 IE(광학 현미경으로 어두운 혈구 색소를 가진 적혈구로 쉽게 식별됨)와 총 세포 수를 세어 최종 기생충혈증(IE의 백분율)을 계산합니다.
메모: 순도가 80% 이상(IE 80%)인 기생충만 사용하십시오.
- 테스트를 위해 계획된 혈청/항체 샘플의 수를 기반으로 필요한 총 IE의 양을 추정하고 그에 따라 기생충 배양을 확장합니다. 5% 헤마토크릿 및 5-10% 기생충혈증에서 25mL의 배양액이 포함된 75cm2 배양 플라스크는 전체 96웰 플레이트를 실행하기에 충분한 IE를 생성해야 합니다. 전체 플레이트(42개 샘플과 6개 대조군 중복 포함)의 경우 3.3 x 107 IEs/mL에서 최소 1.5mL 기생충 현탁액이 필요합니다.
2. THP-1 셀
참고: 이 분석에는 THP-1 세포주가 사용됩니다. 이 단핵구 세포주는 단핵구 백혈병 환자로부터 유래되었으며 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입할 수 있습니다. THP-1 배양 배지에서 공급자의 지침에 따라 세포주를 유지합니다(재료 표 참조).
- 정기적인 유지 관리를 위해 2-4 x 105 cells/mL에서 THP-1 세포 배양을 시작하고 세포 농도가 8 x 105 cells/mL.
에 도달하면 하위 배양을 시작합니다.
메모: 세포 농도가 1 x 106 cells/mL를 초과하지 않도록 하고 계대 수를 추적하십시오. 계대를 벗어난 세포의 사용을 피한다 25. THP-1 세포주의 평균 배가 시간은 19-50시간 사이입니다. phagocytosis 실험을 시작하기 전에 세포 배치의 배가 시간을 측정합니다. 이는 검사할 혈청 샘플의 결정된 수에 필요한 배양량을 대략적으로 추정하는 데 도움이 됩니다(예: 전체 96웰 플레이트의 경우 5 x 105 cells/mL에서 10mL의 배양이 필요함).
- 앞서 설명한 바와 같이 Fcγ-수용체 I(CD64), II(CD32) 및 III(CD16)의 표면 발현에 대해 THP-1 세포를 주기적으로 확인합니다.
- 간단히 말해서, THP-1 세포를 항-CD64, 항-CD32 및 항-CD16 형광 표지 항체(Table of Materials)로 실온에서 30분 동안 염색합니다(1:100 희석, 2% 소 태아 혈청, 인산염 완충 식염수(PBS)에서
준비).
- PBS에서 2% FBS로 3회 세척하고 유세포 분석으로 표면 염색을 측정합니다.
메모: THP-1 세포는 이전에 보고된 바와 같이 CD16에 대해 음성이고 CD32 및 CD64에 대해 양성입니다(그림 1).
- 식세포작용 분석의 경우, 실험 전날 2.5 x 105 cells/mL로 THP-1 세포 배양 플라스크를 설정하여 분석 당일에 약 5 x 105 cells/mL를 산출합니다.
메모: 분석 당일에 4-6 x 105 cells/mL가 존재하는지 확인합니다.
3. 식세포작용 분석(그림 2)
- 분석을 시작하기 전에 PBS에서 웰당 150μL의 멸균 2% FBS를 사용하여 두 개의 둥근 바닥 96웰 플레이트(하나는 옵소니제이션용이고 다른 하나는 식세포작용용)를 블록(>1시간)합니다.
메모: 플레이트 1을 옵소니화 플레이트로 라벨링하고 브롬화 에티듐(EtBr) 염색 및 옵소니화에 모두 사용합니다. Plate 2를 phagocytosis plate로 표시하고 THP-1 cell plating 및 phagocytosis step에 모두 사용합니다.
- 기생충 염색 및 옵소니제이션
- 1.6에서 준비된 IE 현탁액을 취하고 기생충 배양 배지와 브롬화 에티듐(EtBr)을 추가하여 세포 수를 3.3 x 107 IEs/mL로 조정하여 최종 농도 2.5 μg/mL(0.1 mg/mL 스톡에서 1:40 희석)를 달성합니다.
메모: EtBr은 기생충 DNA를 염색하여 유세포 분석으로 검출할 수 있습니다.
주의: EtBr은 돌연변이 유발 물질이며 피부, 눈, 호흡기 자극 물질입니다. 적절한 보호 장치를 사용하고 현지 규정에 따라 폐기물을 처리하십시오.
- 96개의 웰 플레이트(opsonization 플레이트) 중 하나에서 차단 용액을 제거하고 플레이트를 튕기고 수건 종이 조각에 묻은 과도한 액체를 제거합니다.
- 플레이트의 상반부에 위에서 준비한 IE 현탁액의 웰당 30μL를 추가합니다. 웰 하나를 비워 두고 30μL의 기생충 배양 배지를 추가합니다(THP-1 단독 대조군의 경우 IE 제외). (그림 3A). 실온에서 10분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오.
- 기생충 배양 배지 웰당 170μL를 추가합니다. 실온에서 500 x g에서 3분 동안 플레이트를 돌리고 적절한 폐기물 용기 위로 플레이트를 튕겨 상층액을 제거합니다.
- 기생충 배양 배지 웰당 200μL를 사용하여 EtBr 표지된 IE를 실온에서 3분 동안 500 x g으로 플레이트를 회전시켜 두 번 더 세척합니다. 첫 번째 세척의 상등액은 플레이트를 튕겨 제거할 수 있습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 두 번째 세척에서 상등액을 조심스럽게 제거하여 세척 매체의 전체 부피가 제거되었는지 확인합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 기생충 배양 배지에서 원하는 농도로 준비된 30μL의 항체/혈장/혈청 용액에 EtBr 표지된 IE를 다시 현탁시킵니다.
- 항상 다음의 대조군을 포함시킨다 (그림 3B): IEs/THP-1 세포 대조군이 없는 대조군 (기생충 배양 배지); 항체 또는 혈장/혈청이 없는 대조군 (un-opsonized 대조군); 1:100 희석에서 시판되는 rabbit anti-human erythrocyte 항체를 사용하는 positive 대조군 (Table of Materials 참조)); 1:5 희석에서 두 개의 음성 혈장/혈청 대조군(말라리아에 노출된 남성의 풀 및 말라리아에 노출된 남성의 풀); 및 1:5 희석에서 양성 혈청 대조군(이전에 임신한 적이 있는 말라리아에 노출된 여성(바람직하게는 multigravidae)의 풀).
메모: 양성 대조군에 대한 1:100 희석은 구매한 항체의 여러 배치에서 일관되게 작동하는 것으로 보입니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 새로운 항체 배치를 사용할 때마다 여러 희석액을 테스트하여 배치 간의 변동을 배제하는 것이 좋습니다.
- 37 °C의 어둠 속에서 45 분 동안 배양합니다.
- THP-1 세포 준비 및 식세포작용
- IE가 옵소니제이션되는 동안(3.2.8) THP-1 셀 준비를 시작합니다.
- 배양 플라스크에서 THP-1 세포를 제거하고, 스핀 다운하고(실온에서 5분 동안 500 x g), 상등액을 디캔팅하고, THP-1 세포 배양 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
- 다시 회전하고(실온에서 5분 동안 500 x g), 상층액을 디캔팅하고 1mL의 THP-1 세포 배양 배지에 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다.
- 위에서 준비한 용액에서 세포 수를 측정하고 더 많은 배지를 추가하여 5 x 105 cells/mL의 최종 농도를 얻습니다.
- 플레이트를 튕기고 수건 종이 한 장 위에 있는 과도한 액체를 제거하여 나머지 96웰 플레이트(phagocytosis 플레이트)에서 차단 용액을 제거합니다.
- 3.3.4에서 준비한 THP-1 세포 현탁액의 웰당 100μL를 추가하고 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다(그림 3C).
- 항체/혈장/혈청 배양 시간이 끝나면 기생충 배양 배지 웰당 170μL를 첨가합니다. 실온에서 500 x g에서 3분 동안 플레이트를 돌리고 적절한 폐기물 용기 위로 플레이트를 튕겨 상층액을 제거합니다.
- 기생충 배양 배지 웰당 200μL를 사용하여 opsonized IE를 두 번 더 세척하고 실온에서 3분 동안 500 x g에서 플레이트를 회전시킵니다. 첫 번째 세척의 상등액은 플레이트를 튕겨 제거할 수 있습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 두 번째 세척에서 상등액을 조심스럽게 제거하여 전체 세척 매체가 제거되었는지 확인합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 마지막으로, 100μL의 예열된 THP-1 세포 배양 배지에 옵소니화된 IE를 다시 현탁시킵니다. 50μL의 opsonized IE 현탁액을 phagocytosis 플레이트의 각 웰로 전달합니다. 총 100μL의 IE가 있기 때문에 각 항체/혈청 희석액은 식균작용 플레이트(그림 3D)
에서 중복으로 실행할 수 있습니다.
메모: 분석에 사용된 IEs 및 THP-1 세포의 양은 10:1 비율에 해당합니다.
- 37 ° C, 5 % 이산화탄소 (CO2) .
에서 어둠 속에서 40 분 동안 배양하십시오.
메모: 식세포작용이 40분 이상 진행되지 않도록 하십시오.
- 4°C(500 x g, 5분)에서 원심분리로 식균작용을 중지하고 플레이트를 튕겨 상층액을 버립니다. 실온 염화암모늄 용해 용액 150μL(재료 표)를 추가하고 피펫팅으로 혼합한 후 정확히 3분 동안 배양합니다.
메모: 이 단계는 THP-1 세포에 의해 식세포화되지 않은 적혈구를 용해시킵니다.
- PBS에 100μL의 얼음처럼 차가운 2% FBS를 첨가하여 용해를 중지합니다. 플레이트를 4°C(500 x g에서 3분 동안)에서 돌리고 적절한 폐기물 용기 위로 플레이트를 튕겨 상층액을 제거합니다.
- PBS에서 얼음처럼 차가운 2% FBS를 웰당 200μL씩 사용하여 플레이트를 4°C(500 x g에서 3분 동안 3)로 3회 세척합니다. 최종 세척 후 PBS에서 200μL의 얼음처럼 차가운 2% FBS에 다시 현탁하고 즉시 유세포 분석으로 분석합니다.
메모: 이전 간행물에서는 유세포 분석31 전에 2% 파라포름알데히드의 세포 고정을 사용했지만, 여기에 제시된 결과는 분석 완료 직후에 얻은 것입니다. 플레이트를 4°C에 보관하여 유세포 분석 데이터 수집을 연기하는 것은 EtBr+ THP-1 세포의 비율이 빠르게 감소하기 때문에 권장되지 않습니다(그림 4).
4. 유세포 분석 수집 및 분석
참고: 96-well plate 형식을 지원하고 EtBr 형광을 측정하기 위한 적절한 레이저/필터가 있는 모든 유세포 분석기를 사용할 수 있습니다.
- 획득을 위해 IE가 추가되지 않은 웰을 사용하여 선형 전방 산란(FSC) 대 선형 측면 산란(SSC) 플롯을 사용하여 THP-1 셀에서 게이트하고(그림 2A) 이 게이트에서 10,000개의 이벤트를 획득합니다.
- 히스토그램 플롯을 사용하여 THP-1 게이트에서 EtBr(FL3-Log)의 형광 강도를 측정합니다.
- 게이팅의 경우, IE가 추가되지 않은 웰을 사용하여 FSC 대 SSC 밀도 플롯에서 THP-1 셀의 첫 번째 게이트를 사용합니다(그림 5A). 그런 다음 THP-1 셀(IE가 추가되지 않음)과 옵소니즈되지 않은 컨트롤을 사용하여 FL3(EtBr) 히스토그램에서 포지티브 게이트를 설정합니다(그림 5B).
- 동일한 플레이트에서 테스트한 다른 모든 샘플에서 이 게이트를 복사하고 EtBr 양성 THP-1 세포(하나 이상의 IE를 식세포화한 THP-1 세포)의 비율을 측정합니다. 테스트한 각 샘플에 대해 식세포작용은 절대값(EtBr+ THP-1 세포의 비율) 또는 양성 대조군을 최대로 사용하여 백분율로 계산된 상대 식세포작용으로 보고할 수 있습니다.
