형광 리포터를 사용하여 호중구 세린 프로테아제 활성을 측정하기 위한 In vitro Assay

초록

출처: Frey, D. L., et al. 인간 객담 샘플에서 호중구 엘라스타제 및 카텝신 G 활성 모니터링. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 가래 샘플에서 호중구 세린 프로테아제 활성을 정량화하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 분비된 프로테아제를 함유한 샘플은 인식 모티프를 지닌 형광 리포터와 함께 배양됩니다. 프로테아제에 의한 모티프의 절단은 리포터의 공여체 및 수용체 형광단에 의한 개별 형광 방출을 가능하게 하며, 이는 샘플에서 프로테아제 활성을 나타냅니다.

프로토콜

참고: 다음 프로토콜은 시료 준비 및 호중구 세린 프로테아제(NSP) 활성의 정량화를 설명합니다. 여기에 제시된 실험 절차는 인간 객담 및 호중구 엘라스타제(NE) 또는 카텝신 G(CG) 활성 측정에 중점을 둡니다. 그러나 샘플 전처리 프로토콜의 약간의 조정으로 인해 혈액 유래 세포 및 종양 균질체의 분석이 가능해집니다. 또한 매트릭스 금속단백분해효소 및 카텝신 S 활성은 전용 FRET 프로브를 통해 유사하게 조사할 수 있습니다

1. 시료 준비: 세포 분리 및 상층액 분리

참고: 가능하면 가래 치료는 가래 후 120분 이내에 수행해야 하며 가래는 추가 처리 때까지 얼음에 보관해야 합니다.

1. 가래의 자발적 가래가 불가능하면 앞서 설명한 대로 가래를 유도합니다. 간략히, 가래 유도 절차를 시작하기 전에 β-2-수용체-길항제 salbutamol 200 μg을 흡입하십시오. 그 후, 분무기를 사용하여 15분 동안 고긴장제(6%) 식염수를 흡입합니다. 거담이 있는 가래를 페트리 접시에 모으십시오.
2. 피펫 팁을 사용하여 침에서 점액 덩어리를 페트리 접시로 분리합니다.
3. 점액의 무게를 잰다.
   메모: 점액 샘플의 평균 중량은 0.8g(0.1g에서 5g 사이)입니다. 0.1g은 일반적으로 언급된 절차를 수행하기에 충분합니다.
4. 가래에 10% 스푸톨리신(PBS) 4부(v/w)를 추가합니다(예: 가래 1g당 10% 스푸톨리신 4mL).
   주의: Sputolysin은 인산염 완충액에 농축 된 dithiothreitol로 구성되어 있으므로 조심스럽게 다루십시오.
5. 혼합물을 실온(RT)에서 흔들 셰이커에 15분 동안 배양하여 점액을 용해시킵니다. 안전상의 이유로 셰이커를 흄 후드에 넣으십시오.
6. 동일한 부피의 저온 PBS를 첨가하여 반응을 소멸시킵니다(예: 10% 스푸톨리신 1mL당 저온 PBS 1mL).
7. 파이펫팅으로 혼합하여 균일한 용액을 얻습니다.
8. 100μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 50mL 튜브로 여과합니다.
9. 40μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 여과 단계를 반복합니다.
10. 용액을 4°C에서 300 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
11. 상등액 분획을 새 튜브에 조심스럽게 옮기고 ice.
    에 보관하십시오. 메모: 상등액 분획은 추가 분석이 있을 때까지 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
12. 세포 펠릿을 500μL의 차가운 PBS에 부드럽게 재현탁시키고 얼음 위에 놓습니다.
    메모: 세포 분획은 즉시 처리해야 합니다.

2. 호중구 세린 프로테아제 활성 측정

참고: 여기에서는 FRET 기자를 통해 NSP의 활동을 정량화하기 위해 다양한 방법을 소개합니다. 기술의 선택은 구체적인 생물 의학적 질문과 실험의 목적에 따라 결정됩니다. 제시된 프로브는 일련의 폐 관련 효소에 대한 특이성에 대해 광범위하게 테스트되었습니다. 프로브가 표적 효소에 특이적이더라도 항상 관심 있는 임상 샘플에서 프로브 특이성을 확인하십시오. 이는 프로브 추가 전에 특정 단백질 분해 효소 억제제로 샘플을 배양함으로써 달성할 수 있으며, 이는 donor/acceptor(D/A) 비율의 증가를 없애야 합니다.

1. 형광계 또는 플레이트 리더 분석을 통한 용해성 NSP의 활성 정량화
   메모: 샘플의 용해성 분획에서 프로테아제 활성은 형광 검출이 가능한 모든 기기로 검출할 수 있습니다.
   1. 얼음 위에서 효소를 해동합니다.
   2. 사용할 때까지 NE 및 CG를 산성 저장 완충액(50mM 아세트산나트륨, 200mM NaCl, pH 5.5)에 보관하여 자가 절단을 방지하십시오.
   3. 효소 표준 곡선을 설정하려면 활성화 완충액 (pH 10에서 10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl)에서 효소의 1 : 2 연속 희석 (NE의 경우 33.9 - 0.271 nM, CG의 경우 42.6 - 0.333 nM)을 준비합니다. 활성화 버퍼는 중성 pH를 가지므로 효소 촉매가 효율적으로 발생할 수 있습니다.
      1. 가장 높은 표준 농도(NE 농도: 33.9nM)를 준비하려면 999μL의 활성화 완충액에 1μL의 NE(33.9μM)를 희석합니다.
      2. 두 번째 표준물질(NE 농도: 16.95nM)을 준비하려면 200μL의 첫 번째 희석액과 200μL의 활성화 완충액을 혼합합니다.
      3. 그에 따라 나머지 1:2 희석액을 준비합니다.
      4. 마지막 표준인 공백은 순수 활성화 버퍼로 구성됩니다. 기술적 중복 또는 삼중의 측정이 권장됩니다. 표준물질 및 샘플 준비 중에는 바이알을 얼음 위에 두십시오.
   4. 표준 제제와 병행하여 가래 샘플을 활성화 완충액에 희석합니다. 프로테아제 활성을 평가하기 전에 인간 샘플을 희석하여 리포터 신호(D/A 비율) 증가의 선형 범위 내에 유지되도록 합니다. 환자 샘플을 희석하지 않은 상태로 두면 절단이 너무 빨리 발생하여 신뢰할 수 있는 피팅을 할 수 없습니다. 건강한 기증자 객담은 낭포성 섬유증(CF) 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 환자의 샘플에 비해 활성 프로테아제를 더 적게 함유하고 있기 때문에 일반적으로 다양한 희석이 수행됩니다(건강한 객담 상층액의 경우 1:10, COPD 또는 CF 환자의 가래 상층액의 경우 1:20-500).
      메모: 농도를 알 수 없는 샘플에서 단백질 분해 효소 활성을 정량적으로 측정하려면 알려진 효소 농도를 가진 표준 곡선을 병렬로 측정해야 하며, 이상적으로는 동일한 플레이트에서 측정해야 합니다. 인간 객담 내 활성 효소의 농도는 인간 객담 샘플에서 측정된 기울기를 표준 곡선으로 측정된 기울기와 보간하여 계산됩니다.
   5. s를 준비하기 전에amp측정을 위해 기기를 설정하십시오. NE Förster 공명 에너지 전달 기반(FRET) 프로브(NEmo-1)의 여기 파장을 354nm로 설정하고 검출 파장을 공여체의 경우 400nm, 수용체의 경우 490nm로 설정합니다. CG FRET 프로브(sSAM)의 여기 파장을 405nm로 설정하고 방출을 485(도너) 및 580nm(수용체)로 설정합니다.
   6. 표준 또는 블랭크 시료 40μL를 검은색 96웰 절반 면적 플레이트의 웰에 추가합니다.
   7. 리포터를 포함하는 마스터 믹스를 준비하려면(마스터 믹스 내 리포터 농도: 10μM), 프로브 스톡(디메틸설폭사이드, DMSO 내 1mM)을 활성화 버퍼에서 1:100으로 희석합니다. 10 μL x 필요한 플레이트 웰 수를 곱하여 필요한 마스터 믹스 부피를 준비합니다. NEmo-1 및 sSAM 리포터의 형광 측정을 위한 최적의 최종 농도(2 μM)에 도달하려면 각 웰(40 μL의 샘플, 표준 또는 블랭크 샘플 포함)에 10 μL의 마스터 믹스를 추가하고 판독을 시작합니다. 따라서 NEmo-1 및 sSAM 리포터는 각각 용해성 호중구 엘라스타아제와 카텝신 G 활성을 모니터링할 것입니다.
      메모: 시약 주입기를 사용할 수 없는 경우, 리포터가 샘플에 추가된 후 가능한 한 빨리 판독을 시작해야 합니다.
   8. 플레이트 리더 측정을 시작하고 최소 60분 동안 또는 신호 증가가 고원에 도달할 때까지 90-20초마다 D/A 비율 증가를 기록합니다.
   9. 데이터를 내보내면 각 시점 및 샘플에 대해 donor relative fluorescence units (RFU)를 acceptor RFU로 나누어 D/A 비율을 계산합니다.
   10. 각 표본의 D/A 비율, 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
   11. D/A 비율 변화의 선형 성장 내에서 기울기를 결정합니다. 기울기는 FRET 프로브에 대한 효소 절단 속도의 지표입니다. 인간 샘플에서 파생된 선형 회귀 기울기를 효소 표준물질에서 계산된 기울기에 맞춰 객담 내 활성 효소의 농도를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 μm 나일론 셀 스트레이너	코닝 Inc.	431752
2300 EnSpire(다중 라벨 플레이트 리더)	퍼킨엘머
35x10mm 접시, Nunclon 델타	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	150318
40 μm 나일론 셀 스트레이너	코닝 Inc.	제431750
50 mL 튜브	사르슈테트	10535253
저울	OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. (오하우스 인스트루먼트 (상하이) Co., Ltd.	홍보124
BD Falcon 둥근 바닥 튜브 5 mL	BD 생명과학	352054
BD LSR포르테사 세포 분석기	BD 생명과학
블랙 플랫 바닥 96 웰 절반 면적 플레이트	코닝 생명과학	3694
카텝신 G	엘라스틴 제품 회사	SG623
카텝신 G 억제제 I	머크 KGaA	219372
원심분리기 5418R	에펜도르프 AG	EP5401000137
Combitips 고급 1.0 mL	에펜도르프 AG	0030 089 430
완전한 단백질분해효소 억제제	로슈	11697498001
인간 객담 백혈구 엘라스타아제	엘라스틴 제품 회사	SE563
멀티펫 플러스	에펜도르프 AG
네모-1	시켐	사우스 캐롤라이나-0200	1 밀리엠
네모-2E	시켐	사우스 캐롤라이나-0201	2 밀리엠
LC Sprint 제트 분무기가 있는 Pari Boy SX	빠리	085G3001
인산염 완충 식염수	지브코	10010-015
ROTI Histokitt(장착 매체)	칼 로스 GmbH + Co.KG	6638.1
살부타몰	테바 GmbH
시벨레스타트	케이맨 화학 물질	17779
스푸톨리신	칼바이오켐	560000-1세트
에스샘	사내에서		2 밀리엠

) 호 시리즈 년 년