전혈을 이용한 신속한 호중구 화학요법 분석을 위한 미세유체 칩 기반 방법

초록

출처: Yang, K., et al. 혈액 한 방울에서 직접 신속한 호중구 화학요법 분석을 위한 All-on-chip 방법. J. Vis. 특급 (124), (2017년)

이 동영상은 all-on-chip 방법을 사용한 호중구 화학주성 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 면역자기 음성 선택에 의해 전혈에서 호중구를 직접 분리한 후 미세유체 칩에서 화학주성 분석을 수행할 수 있습니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 미세유체 장치 준비.

1. 미세유체 세포 이동 분석 준비
   1. 생물 안전성 작업대 내부의 950 μL Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)에 50 μL의 스톡 피브로넥틴 용액(1 mg/mL)을 희석하여 50 μg/mL 피브로넥틴 용액을 준비합니다.
   2. Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI-1640) 9mL와 RPMI-1640 1mL를 4% 소 혈청 알부민(BSA)과 혼합하여 이동 배지를 준비합니다.
   3. 장치에서 탈이온수를 제거합니다.
   4. 배출구에서 100μL 피브로넥틴 용액을 장치에 추가합니다. 모든 채널이 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 3분 정도 기다립니다. 미세유체 장치를 실온에서 1시간 동안 덮개를 덮은 페트리 접시에 놓습니다.
   5. 장치에서 피브로넥틴 용액을 제거합니다. 배출구에서 100μL 이동 배지를 추가합니다. 모든 채널이 마이그레이션 매체로 채워질 때까지 3분 정도 기다립니다.
   6. 실온에서 1시간 더 장치를 배양하면 화학주성 실험을 할 준비가 된 것입니다.
2. 화학주성 실험을 위한 화학유인제 용액 제조.​
   1. 총 1mL 이동 배지에서 100nM fMLP 용액을 준비합니다. 1.5mL 튜브에서 5μL의 FITC-덱스트란(10kDa, 1mM)을 fMLP 용액과 혼합합니다.
      메모: FITC-Dextran은 기울기 측정에 사용됩니다. 또는 로다민(Rhodamine)을 기울기 지표로 사용합니다. 그런 다음 fMLP 화학유인 용액을 화학주성 실험에 사용할 준비가 됩니다.
3. 객담 샘플 준비.
   메모: COPD 환자의 가래 샘플의 구배에 의해 유도된 호중구 화학주성은 이 올-온-칩 방법의 임상 진단 애플리케이션으로 테스트되었습니다.
   1. COPD 환자로부터 가래 샘플을 채취하기 위한 인간 윤리 프로토콜을 획득합니다.
      메모: 우리는 위니펙에 있는 Seven Oaks General Hospital에서 샘플을 채취할 수 있는 승인을 받았습니다(매니토바 대학에서 승인).
   2. 모든 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의서를 받습니다.
   3. COPD 환자의 자발적 가래 샘플을 수집합니다. 500μL 가래 샘플을 1.5mL 튜브에 넣습니다.
   4. 1.5mL 튜브에 500μL 0.1% 디티오트레이톨을 넣고 부드럽게 섞습니다. 튜브를 37°C의 수조에 15분 동안 넣습니다.
   5. 753 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리한 다음 상층액을 수집합니다. 865 x g에서 5분 동안 상층액을 원심분리한 다음 최종 상층액을 수집합니다. 포집된 상등액은 사용하기 전에 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
   6. 화학주성 실험을 할 준비가 되면 객담 용액을 해동하고, 900μL 이동 배지를 1.5mL 튜브로 옮기고 생물안전성 캐비닛 내에서 100μL 객담 용액과 혼합합니다. 객담 용액은 화학주성 실험을 위해 준비됩니다.
4. 혈액 샘플 수집.
   1. 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 수집하기 위한 인간 윤리 프로토콜을 획득합니다. 모든 헌혈자로부터 정보에 입각한 서면 동의서를 받으십시오.
      메모: 여기에서 샘플은 위니펙의 빅토리아 종합 병원(매니토바 대학의 합동 교수 연구 윤리 위원회에서 승인)에서 얻었습니다.
   2. 정맥 천자로 혈액 샘플을 채취하고 샘플을 EDTA 코팅된 튜브에 넣습니다. 실험 전에 튜브를 생물 안전 캐비닛에 보관하십시오.

2. All-on-chip Chemotaxis Assay Operation

1. 온칩 셀 절연(그림 1B).
2. 생물 안전 캐비닛 내부의 1.5mL 튜브에 10μL 전혈을 넣습니다.
   메모: 혈액 샘플 수집에 대한 자세한 내용은 섹션 1.4에 나와 있습니다.
3. 호중구 분리 키트(재료 표 참조)에서 2μL 항체 칵테일(Ab)과 2μL 자성 입자(MP)를 1.5mL 튜브에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 이렇게 하면 호중구를 제외한 혈액 내 세포에 라벨이 표시됩니다.
4. 혈액-Ab-MP 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   메모: 이것은 혈액에서 항체 표지된 세포에 자기적으로 태그를 붙입니다.
5. 두 개의 작은 자기 디스크를 장치의 셀 로딩 포트 양쪽에 부착합니다. 장치의 모든 포트에서 매체를 흡인합니다.
6. 세포 로딩 포트에서 미세유체 장치로 2μL 혈액-Ab-MP 혼합물을 천천히 피펫으로
   참고: 자기적으로 표지된 세포는 세포 로딩 포트의 측벽에 갇히는 반면 호중구는 장치로 흘러 들어가 세포 도킹 구조에 갇히게 됩니다.
7. 세포 도킹 영역에 충분한 호중구가 갇힐 때까지 몇 분 정도 기다립니다.

3. 화학주성 분석법(그림 1C).

1. 미세유체 장치를 37°C의 온도 제어 현미경 스테이지에 놓습니다.
2. 두 개의 피펫터를 사용하여 100μL 화학유인 용액(fMLP 또는 객담 용액)과 100μL 이동 배지를 지정된 입구 저장소에 추가합니다. 이는 압력 균형 구조의 도움을 받는 연속적인 층류 기반 화학 혼합에 의해 구배 채널에서 화학유인 구배를 생성합니다.
   메모: COPD 환자의 객담 채취에 대한 자세한 내용은 섹션 1.3에 나와 있습니다.
   1. 매체 제어 실험의 경우 두 입구 저장소 모두에 마이그레이션 매체만 추가합니다.
3. 그래디언트 채널에서 FITC-Dextran의 형광 이미지를 획득합니다.
4. "파일|Open"입니다.
5. gradient channel 전체에서 형광 강도 프로파일을 "Analyze|플롯 프로파일".
6. 추가 플로팅을 위해 측정 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
7. 온도 제어 현미경 스테이지 또는 기존 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 장치를 배양합니다.
8. 데이터 분석을 위해 세포의 최종 위치를 기록하기 위해 10X 대물렌즈를 사용하여 그래디언트 채널을 이미지화합니다.
9. 필요한 경우 타임 랩스 현미경으로 장치의 세포 이동을 기록합니다.

4. 세포 이동 데이터 분석(그림 1C)

1. 아래 설명된 대로 도킹 구조로부터의 세포 이동 거리를 계산하여 화학주축 분석을 분석합니다. 그림 1C를 참조하십시오.
2. 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어(버전 1.45)로 가져옵니다.
3. 그라디언트 채널로 이동한 각 셀의 중심을 선택합니다.
4. 선택한 셀의 최종 위치에 대한 좌표를 측정합니다. 도킹 구조체의 가장자리에 있는 점의 좌표를 초기 참조 위치로 측정합니다.
5. 측정된 좌표 데이터를 스프레드시트 소프트웨어(예: Excel)로 내보냅니다. 셀의 이동 거리를 그래디언트 방향을 따라 셀의 최종 위치와 초기 참조 위치 간의 차이로 계산합니다.
6. 거리를 마이크로미터 단위로 보정합니다. 모든 세포의 이동 거리의 평균과 편차를 화학주성의 척도로 계산합니다.
7. 화학유인 구배가 있는 경우의 이동 거리를 스튜던트 t-검정을 사용하여 중간 대조군 실험과 비교합니다.
8. 세포 이동의 타임 랩스 이미지가 기록되면 세포 추적 분석을 통해 세포 이동 및 화학주성을 추가로 분석할 수 있습니다.
   메모: all-on-chip chemotaxis assay를 구성하고 수행하는 데 필요한 재료는 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다.

결과

그림 1: 호중구 화학주성 분석을 위한 all-on-chip 분석법 그림. (A) 미세유체 장치의 그림. 이 장치에는 두 개의 레이어가 있습니다. 첫 번째 레이어(4μm 높이)는 세포 도킹 장벽 채널을 정의하여 그래디언트 채널 옆에 있는 세포를 가둡니다. 두 번째 층(높이 60μm)은 그래디언트 생성 채널, 셀 로딩을 위한 포트 및 채널, 화학 물질 주입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 맞춤 표시는 두 레이어에 대해 설계되었습니다. 두 번째 레이어의 경우 업스트림 구불구불한 입력 채널의 길이와 너비는 각각 60mm 및 200μm입니다. 다운스트림 구불구불한 입력 채널의 길이와 너비는 각각 6mm 및 280μm입니다. (B) all-on-chip cel...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장치 제작
마스크 얼라이너	증권 시세	해당 사항 없음
회전자	솔리텍	5000
열판	폭스바겐	제11301-022
플라즈마 클리너	해릭 플라즈마	PDC-001
진공 건조제	피셔 사이언티픽	08-594-15ᄀ
SU-8 2000 시너	마이크로켐	SU-8 2000
SU-8 2025 포토레지스트	마이크로켐	SU-8 2025
(트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)트리클로로실란	젤레스트	78560-45-9
Si 웨이퍼	실리콘, Inc	LG2065
유리 슬라이드	피셔 사이언티픽	제12-544-4
커팅 패드	해당 사항 없음	해당 사항 없음	주문 제작
펀처
온칩 세포 분리 및 화학주성 분석
RPMI 1640	피셔 사이언티픽	SH3025502
디피에스	피셔 사이언티픽	SH3002802
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	SH3057402
피브로넥틴	폭스바겐	CACB356008
에프MLP	시그마-알드리치	F3506-10MG
자기 디스크	인디고 악기	제44202-1	직경 5mm, 두께 1mm
FITC-덱스트란	시그마-알드리치	FD10S
로다민	시그마-알드리치	R4127-5G
Giemsa 얼룩 용액	로울리 생화학 Inc	G-472-1-8온스
EasySep Direct 인간 호중구 분리 키트	스템셀 테크놀로지스 Inc	19666년
디티오트레이톨	시그마-알드리치	D0632
Nikon Ti-U 도립 형광 현미경	니콘	티유
현미경 환경 챔버.	인비보사이언티픽	해당 사항 없음
CCD 카메라	니콘	DS-파이1