암세포에 대한 사전 활성화된 CD8+ T 세포의 세포 독성을 연구하기 위한 체외 분석

초록

출처: Kitamura, T., et al. 종양 침윤 골수성 세포의 면역 억제 기능을 연구하기 위해 CD8⁺ T 세포에 의해 유도된 체외 종양 세포 사멸의 실시간 검출. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 사전 활성화된 이펙터 T 세포에 의해 유도된 암세포의 세포사멸 분석을 보여줍니다. 이러한 세포를 형광 핵으로 표시된 암세포와 함께 배양함으로써 카스파제로 절단할 수 있는 형광 기질을 추가합니다. 세포사멸 암세포는 핵에서 다른 색을 표시하여 이중 형광을 유발합니다. 이 이중 형광은 암세포가 세포사멸을 겪고 있음을 나타냅니다.

프로토콜

1. 핵에서 적색 형광 단백질을 발현하는 표적 세포의 준비

1. 적절한 출처에서 표적 마우스 암 세포주를 얻습니다.
   메모: 이 프로토콜에서는 E0771 마우스 유선종양 세포(E0771-LG)의 고도로 전이된 유도체가 사용됩니다. 부모 E0771 세포는 C57BL/6 마우스에서 유래합니다.
2. 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂.
   의 세포 배양 인큐베이터에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)을 포함한 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagles Medium)으로 E0771-LG 세포 바이알을 해동 및 유지 관리합니다. 메모: 세포가 마이코플라스마에 대해 음성임을 확인해야 합니다. 이를 위해 E0771 세포(또는 검사 대상 세포)를 상기와 같이 2-3일 동안(항생제 및 항진균제가 없는 경우) 배양하고 500μL의 배양 배지를 수집합니다. 12,419 x g에서 60초 동안 배지를 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 시중에서 판매되는 마이코플라스마 테스트 키트(재료 표 참조) 및/또는 제조업체의 지침에 따라 PCR을 사용하여 마이코플라스마 오염을 확인합니다.
3. 웰당 5 x 10³ E0771-LG 세포를 12웰 플레이트에 시딩하고 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂.
   의 인큐베이터에서 10%(v/v) FBS-DMEM으로 세포를 밤새 배양합니다. 메모: 타겟 세포의 증식률이 낮으면(집단 배가 시간이 36시간 이상) 세포 수를 1 x 10⁴로 늘릴 수 있습니다.
4. 배지를 10μg/mL 폴리브레렌을 포함한 10%(v/v) FBS-DMEM 1mL로 교체하고 핵 제한 적색 형광 단백질(mKate2, 재료 표 참조)을 인코딩하는 25μL의 렌티바이러스 입자(1 x 10,^6TU/mL)를 추가합니다.
5. 인큐베이터에서 37°C, 습도 95%, CO₅% 2에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
6. 배지를 10%(v/v) FBS-DMEM으로 교체하고 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 24-48시간 동안 세포를 배양합니다.
7. 세포가 적색 형광 단백질을 발현하기 시작할 때 배지를 1μg/mL 퓨로마이신을 포함한 10%(v/v) FBS-DMEM으로 교체하고 80-90% 농도가 될 때까지 세포를 배양합니다.
   메모: 퓨로마이신의 농도는 표적 세포 유형에 따라 다르며 transfection되지 않은 세포를 사용하여 최적화해야 합니다.
8. 1μg/mL 퓨로마이신을 포함한 10%(v/v) FBS-DMEM으로 1-3개의 계대 동안 살아남은 세포를 계대배양하고 사용할 때까지 액체 질소 기상 저장 시스템에서 동결 보존 스톡을 계
대배양합니다.

2. 생쥐의 종양에서 억제 세포 분리

참고: 이 프로토콜에서 억제 세포(즉, 전이 관련 대식세포(MAM) 및 단핵-골수성 유래 억제 세포(M-MDSC))는 E0771-LG 세포에 의해 확립된 전이성 종양이 포함된 폐에서 분리됩니다. 조직 해리 및 세포 분류를 위한 조건은 다른 조직에서 세포를 분리하기 위해 최적화되어야 합니다.

1. 1 x 10⁶ 암세포(E0771-LG)를 합성학(C57BL/6), 암컷, 7-10주 된 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다.
2. 14일 후, 전이성 종양이 포함된 폐를 분리하고 앞서 설명한 대로 효소 분해를 통해 관류된 폐에서 단세포 현탁액을 준비합니다.
   메모: 이 프로토콜에서는 4개의 마우스에 암세포를 주입하고 전이성 폐를 결합하여 충분한 억제 세포를 얻습니다.
3. 얼음에서 30분 동안 항 마우스 CD16/CD32 항체로 단일 세포 현탁액을 배양하고 CD45, F4/80, CD11b, Ly6C 및 Ly6G(재료 표 참조)에 대한 형광 항체로 염색합니다.
4. 염색된 세포를 2%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 PBS 1mL로 한 번 세척하고 2%(w/v) BSA를 함유한 PBS 500–1000μL로 세포 펠렛을 다시 현탁합니다.
5. 3μM의 DAPI를 추가하고 세포 분류기를 사용하여 M-MDSC(DAPI^–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^높음, Ly6C^높음) 및 MAM(DAPI^–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^높음, Ly6C^낮음)을 정렬합니다(그림 1).
   메모: MAM(Ly6Clow)과 M-MDSC(Ly6Chigh)를 구별하기 위한 Ly6C 수치의 임계값은 상주 폐포 대식세포(RMAC)의 임계값을 기반으로 합니다. 분류된 세포의 순도는 90% 이상의 예상 순도로 유세포 분석을 통해 측정됩니다.
6. 분류된 세포를 20%(v/v) FBS, 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 1%(v/v) 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨 및 50nM 2-메르캅토에탄올(enriched-DMEM, E-DMEM이라고 함)을 포함하는 400μL의 DMEM으로 재현탁합니다.
7. Trypan blue exclusion 방법을 사용하여 살아있는 세포의 수를 계산하고 E-DMEM을 사용하여 2 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.
8. 사용할 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.

3. 생쥐의 비장에서 CD8⁺ T 세포 분리

1. 다음과 같이 표적 암 세포주와 syngeneic 마우스(즉, 이 프로토콜에서 C57BL/6 마우스)로부터 비장을 분리합니다.
   1. CO₂ 흡입으로 동물을 안락사시킵니다.
   2. 깨끗한 해부판에 동물을 놓고 70%(v/v) 에탄올로 피부를 닦습니다.
   3. 비장을 드러내기 위해 가위를 사용하여 복부 피부를 자릅니다
   .
   4. 위보다 아래쪽에 위치한 비장을 분리하여 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 튜브에 넣습니다.
2. 멸균 5mL 주사기의 내부 플런저를 사용하여 50mL 튜브에 설정된 100μm 세포 여과기에서 비장을 분쇄합니다.
3. 총 10mL의 PBS를 사용하여 세포를 필터에 통과시킵니다.
4. 337 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
5. 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.5%(w/v) BSA(러닝 버퍼)가 포함된 PBS 1mL에 세포 펠렛을 재현탁하고 40μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.
6. 살아있는 세포 수를 세고 실행 중인 buffer.
   를 사용하여 1 x 10⁸ cells/mL로 조정합니다. 메모: 순도 검사를 위해 소량의 세포 분취량을 농축 전 샘플로 보관합니다.
7. negative selection kit 및 magnetic sorter를 사용하여 CD8⁺ T cell을 농축합니다(Table of Materials 참조).
   1. 비장 세포 세포 1 x 10⁸ (1 mL)을 5 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
   2. 50μL의 비오틴화 항체를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   3. 125μL의 스트렙타비딘 복합 마그네틱 비드를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 러닝 버퍼 1.325mL를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
   5. 튜브를 자석에 넣고 실온에서 2.5분 동안 배양합니다.
   6. 자석을 집어 들고 농축된 세포 현탁액을 새 튜브에 붓습니다.
8. 농축된 세포를 200μL의 E-DMEM(즉, 20%(v/v) FBS, 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 1%(v/v) 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨 및 50nM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 DMEM)으로 재현탁합니다.
9. 살아있는 세포의 수를 세고 E-DMEM을 사용하여 2 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 사용할 때까지 CO₂ 인큐베이터에서 셀을 37°C로 유지하십시오.
   메모: 순도 검사를 위해 농축 후 샘플로 소량의 세포 분취량을 보관합니다.
10. CD8⁺ T cell의 순도는 다음과 같이 유세포 분석으로 측정합니다.
    1. 농축 전(단계 3.6) 또는 농축 후(단계 3.9) 샘플에서 1 x 10⁴ 세포를 채취하고 러닝 버퍼를 사용하여 각각의 총 부피를 100μL로 조정합니다.
    2. 얼음에서 30분 동안 항마우스 CD16/CD32 항체가 포함된 단일 세포 현탁액을 배양하고 CD45, CD3, CD4 및 CD8(재료 표 참조)에 대한 형광 항체로 30분 더 염색합니다.
    3. 2%(w/v) BSA를 함유한 500 μL의 PBS로 염색된 세포를 세척하고, 2%(w/v) BSA를 함유한 500–1000 μL의 PBS로 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다.
11. 3μM의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 추가하고 전체 CD45⁺ 세포 집단에서 CD3⁺CD4^–CD8⁺ 세포의 비율을 측정합니다.

4. 분리된 CD8⁺ T 세포의 활성화 및 증식

1. 50 μL CD8⁺ T 세포(3.9단계에서 준비)당⁵개의 세포를 U-bottom 96-well plate의 well로 분취합니다.
2. 50μL 서프레서 셀당 1 x 10,⁵ 셀(단계 2.7에서 준비) 또는 50 μL의 E-DMEM을 웰에 추가합니다.
3. E-DMEM, 4 x 10⁴ U/mL 집락자극인자 1 (CSF-1), 240 U/mL 인터루킨-2 (IL-2), 8 μg/mL 항-마우스 CD3ε 항체 및 16 μg/mL 항-마우스 CD28 항체로 구성된 활성화 배지를 준비합니다.
   메모: CSF-1은 T 세포 활성화에 필요하지 않지만, 이 프로토콜에서 억제 세포(즉, MAM 및 M-MDSCs)의 생존에 필수적입니다. 따라서, 배양 조건에서 일관성을 유지하기 위해 표적 암 세포와 T 세포의 공동 배양에서 유지됩니다. CSF-1은 모든 조직의 나노 몰 농도에서 발견되며 생체 내 단핵구/대식세포 생존에 필요하기 때문에 이는 이러한 세포에 대한 생리학적 맥락입니다.
4. 50μL의 활성화 배지(단계 4.3)와 50μL의 E-DMEM(시약 유무)을 추가할 시약을 추가합니다.
5. 플레이트를 37°C, 습도 95%, CO_{5% 2}의 인큐베이터에 넣고 4일 동안 세포를 배양합니다.

5. 사전 활성화된 CD8⁺ T 세포와 타겟 세포의 공동 배양 설정

1. 30 μL의 1:100 희석 성장 인자 감소 용해성 기저막 매트릭스(재료 표)를 현미경 검사에 적합한 평평한 바닥 96웰 플레이트의 웰에 추가하고 37°C에서 CO₂ 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
2. 표적 세포(즉, 핵 제한 적색 형광 단백질을 발현하는 E0771-LG 세포)를 준비합니다.
   1. 1mL의 0.05% 트립신/EDTA로 타겟 세포를 실온에서 1분 동안 배양하고 부드러운 피펫팅으로 세포를 수확합니다.
   2. 10%(v/v) FBS를 포함한 DMEM 9mL를 첨가하고 337 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
   3. 500μL의 E-DMEM으로 세포를 다시 현탁시키고 살아있는 세포의 수를 계산합니다.
      메모: 표적 세포를 계수하기 전에 40μm 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
   4. E-DMEM을 추가하여 밀도를 2 x 10⁴ cells/mL (= 1 x 10³ cells per 50 μL)로 조정하고 세포를 얼음 위에 유지합니다.
3. effector 세포(즉, 사전 활성화된 CD8⁺ T 세포)를 준비합니다.
   1. 피펫팅을 통해 96웰 플레이트의 웰에 세포를 철저히 재현탁하고(단계 4.5), 부유 CD8⁺ T 세포를 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      메모: MAM 및 M-MDSC는 웰에 단단히 부착되며 피펫팅에 의해 분리되지 않습니다.
   2. 나머지 세포를 수집하려면 PBS 200μL를 웰에 추가하고 5.3.1단계에서 튜브로 옮깁니다.
   3. 1mL의 E-DMEM으로 세포를 5분 동안 한 번 세척하고(337 x g에서 원심분리) 상층액을 흡인 및 폐기), 100μL의 E-DMEM으로 다시 현탁시킵니다.
   4. 트리판 블루 배제 방법 사용, 살아있는 세포의 수를 세고, 밀도를 1.6 x 105 cells/mL (= 4 x 10³ cells/25 μL)로 조정하고, 세포를 얼음 위에 보관합니다.
4. 5.1단계에서 플레이트의 각 웰에서 기저막 매트릭스를 흡인합니다.
5. 각 웰에 1 x^{10 3} cells/50 μL의 타겟 셀(단계 5.2.4)을 추가하고 well.
   메모: 매체의 증발로 인한 가장자리 효과를 방지하려면 96웰 플레이트의 내부 60웰만 분석에 사용해야 합니다.
6. 4 x 10,³ U/mL IL-2 및 10 μM 형광 카스파제-3 기질을 포함한 25 μL의 E-DMEM을 추가합니다(재료 표 참조).
7. 4 x 10³ cells/25 μL의 CD8⁺ T cell(step 5.3.4)을 적절한 well에 넣고 well.
   메모: 웰에 너무 많은 세포가 존재하면 분석이 더 어려워집니다. 이 모델에서는 4:1 effector: target ratio(총 셀 수 5 x 10³ cells/well)가 최적이었지만 8:1 비율은 최적이 아니었습니다. 데이터 분석을 돕기 위해 다음 4가지 대조군을 포함하는 웰이 필요합니다: 카스파제-3 기질이 있거나 없는 배지의 공동 배양 웰(1 x 10³ cells/well)에 사용되는 밀도의 표적 세포, 카스파제-3 기질이 있거나 없는 배지의 effector cell(1 x 10³ cells/well).
8. 200μL의 PBS 또는 멸균수를 모든 빈 웰(특히 플레이트 주변의 웰)에 추가하여 실험용 웰에서 매체의 증발을 줄입니다.
9. 플레이트를 37°C, 95% 습도 및 5% CO₂.
   로 유지되는 저속 형광 현미경에 넣습니다. 메모: 플레이트를 십자형으로 흔들어 모든 세포가 고르게 분포되도록 한 다음 플레이트를 인큐베이터로 옮기기 전에 평평한 표면의 실온에 10-20분 동안 그대로 두십시오.

6. 세포의 이미징

참고: 자세한 이미지 획득 설정은 사용된 현미경 및 형광단에 따라 다릅니다. 최적의 결과를 얻으려면 다음과 같은 일반 획득 매개변수를 사용해야 합니다.

1. 현미경의 적절한 자동 초점 루틴을 사용하여 96웰 플레이트의 각 실험 웰에서 전체 표면적의 최소 25%를 커버하는 이미지를 획득합니다.
2. 현미경을 설정하여 위상차와 핵 제한 적색 형광 단백질(mKate2)에 적합한 형광 채널과 녹색 형광 활성 카스파제-3 기질(488nm에서 여기)에 적합한 형광 채널을 획득하도록 설정합니다(그림 2).
3. 실험용 웰에서 위상차와 최소 72시간 동안 1-3시간마다 2개의 형광 채널을
캡처합니다.

결과

그림 1. 전이성 폐에서 억제 세포를 분리하기 위한 게이팅 전략. (A) 단핵 골수성 유래 억제 세포(M-MDSC) 및 전이 관련 대식세포(MAM)를 분리하기 위한 대표적인 점도표. MAM(Ly6C^낮음)과 M-MDSC(Ly6C^높음)를 구별하기 위한 Ly6C 수치의 임계값은 상주 폐포 대식세포(RMAC)의 임계값을 기반으로 합니다. (B) 분류된 M-MDSC(CD45⁺Ly6G-CD11b⁺Ly6C^높음) 및 MAM(CD45⁺Ly6G-CD11b⁺Ly6C^낮음)의 순도.

...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신 EDTA (1X)	지브코	제25300-054
12웰 세포 배양 플레이트	프라이너 바이오 원	665-180
PBS 1개	지브코	제14190-094
2-메르캅테탄올	시그마	M6250-10ML
5mL 플라이스티렌 라운드 바닥 튜브	송골매	352054
96-Well Cell Culture Plate (둥근 바닥)	코스타	3799	CD8+T 세포와 분류된 골수성 세포의 공동 배양
96웰 플레이트(바닥이 편평함)	눕크	165305	세포독성 분석을 위한 CD8+T 세포와 표적 세포의 공동 배양
AF647 안티-마우스 F4/80 항체	바이오 래드	MCA497A647	클론: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 항체	바이오레전드	100730	복제: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 항체	바이오레전드	102111	분리된 CD8+ T 세포의 활성화, 클론: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e 항체	바이오레전드	100314	분리된 CD8+ T 세포의 활성화, 클론: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 항체	바이오레전드	100236	클론: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 ly6C 항체	바이오레전드	128026	클론: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
소 세럼 Albmin	시그마	A1470-100지
셀 스트레이너 (100μm 나일론)	송골매	제352360	비장을 부수기 위해
셀 스트레이너(40μm 나일론)	송골매	352340	폐 소화를 여과하기 위해
다피	바이오레전드	422801
Dulbecco의 변형 독수리의 매체	지브코	제41966-029
EasySep 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트	스템셀 기술	19853
소 태아 세럼	지브코	10270-106
FITC anti-mouse CD4 항체	바이오레전드	100406	클론: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex 즉시 사용 가능	지브코	대답1596-01	세포 독성 분석을 위한 96웰 플레이트 코팅
IncuCyte NucLight 레드 렌티바이러스 시약	에센 바이오사이언스	4476	mKate2를 인코딩하는 렌티 바이러스 미립자
IncuCyte 줌	에센 바이오사이언스		검출기(형광 현미경)
인큐사이트 줌 2018A	에센 바이오사이언스		해석 소프트웨어
L-글루타민(100X)	지브코	A2916801
폐 해리 키트	밀테니	Tel.: 130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung(종양이 있는 폐에서 단세포 현탁액의 제조
MycoAlert 마이코플라스마 검출 키트	론자	LT07-318
비필수 아미노산(100X)	지브코	제11140-035
누크뷰488	비오티움	10403	형광유발 카스파제-3 기질
PE anti-mouse Ly6G 항체	바이오레전드	127607	복제: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b 항체	바이오레전드	101216	복제: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
펜 스트렙	지브코	15140-122	세포의 1차 배양을 위한 페니실린 스트렙토마이신
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 항체	바이오레전드	103132	복제: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)	시그마	H9268
푸로마이신	지브코	A11138-03
RBC 용해 버퍼(10X)	바이오레전드	420301
재조합 쥐 IL-2	페프로텍	212-12	분리된 CD8+ T 세포의 활성화
피루브산 나트륨 (100X)	지브코	제11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) 항체	바이오레전드	101320

호 년 호 년 조 호 년 년 ) 호 년 년 년 호