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방법 논문

대식세포에서 다중 카스파제의 활성화에 대한 평가

856 조회수

⸱

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

출처: Han, J. et al., 선천성 면역 세포 사멸을 평가하기 위한 카스파제 활성화의 평가.J. Vis. 특급(2023년)

이 비디오는 인플루엔자 바이러스를 자극하여 골수 유래 대식세포에서 여러 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을 보여줍니다. 대식세포 용해, 용해물의 열 불활성화 및 원심분리 후 후속 면역학적 분석을 위해 세포 내 카스파제를 수집합니다.

프로토콜

1. 솔루션 준비

  1. L929 컨디셔닝 매체를 준비합니다.
    1. 플레이트 1 × 106 L929 세포(재료 표 참조)를 50mL의 L929 배양 배지가 포함된 182cm2 조직 배양 플라스크에 넣습니다(배지 준비는 표 1 참조).
    2. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소, CO2로 세포를 성장시킵니다.
    3. 7일 후 상층액을 채취하여 0.45μm 필터를 사용하여 여과합니다. 50mL 부분 표본을 준비합니다(최대 1년 동안 -80°C에서 냉동 부분 표본 보관).
  2. 500mL의 골수 유래 대식세포(BMDM) 배양 배지를 준비합니다(표 1).
  3. 500mL의 BMDM 자극 매체를 준비합니다(표 1).
  4. 감염을 위해 500mL의 배지를 준비합니다(표 1).
  5. 100mL의 1M Tris 버퍼를 준비합니다(표 1).
  6. 4x 도데실황산나트륨(SDS) 완충액을 준비합니다(표 1).
  7. 1m 1,4-디티오트레이톨 1mL를 준비합니다(DTT, 표 1).
  8. 40mL의 카스파아제 용해 완충액을 준비합니다(표 1).
  9. 100mL의 1.5M Tris 완충액을 준비합니다(표 1).
  10. 10%(wt/vol) SDS 용액 100mL를 준비합니다(표 1).
  11. 2x 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액 50mL를 준비합니다(표 1).
  12. 5mg/mL 지질다당류, LPS 용액을 준비합니다(표 1).
  13. 0.5M 아데노신 삼인산, ATP 용액을 준비합니다(표 1).
  14. 웨스턴 블로팅 용액을 준비합니다.
    1. 1L의 5x 러닝 버퍼 스톡을 준비합니다(표 1).
    2. 10x 전송 버퍼 스톡 1L를 준비합니다(표 1).
    3. Tween 20으로 Tris-buffered Saline 1L를 준비합니다(TBST, 표 1).
    4. 100mL의 5%(wt/vol) 탈지 우유 차단 용액을 준비합니다(표 1).
  15. 1차 항체 용액을 준비합니다.
    1. 10mL의 카스파제-1 1차 항체를 준비합니다(표 1).
    2. 10mL의 카스파제-11 1차 항체를 준비합니다(표 1).
    3. 10mL의 카스파제-3 1차 항체를 준비합니다(표 1).
    4. 10mL의 카스파제-7 1차 항체를 준비합니다(표 1).
    5. 10mL의 카스파제-8 1차 항체를 준비합니다(표 1).
    6. 10mL의 카스파제-9 1차 항체를 준비합니다(표 1).
    7. HRP-conjugated β-actin 1차 항체 10mL를 준비합니다(표 1).
  16. 2차 항체 용액을 준비합니다.
    1. 항토끼 2차 항체 10mL를 준비합니다(표 1).
    2. 10mL의 항마우스 2차 항체를 준비합니다(표 1).
    3. 10mL의 항쥐 2차 항체를 준비합니다(표 1).

2. 골수 유래 대식세포 분리

참고: 이 프로토콜의 경우, 온전하게 프로그래밍된 세포 사멸(PCD) 경로를 가진 6-10주 된 야생형 마우스 또는 PCD 조절자, 효과기 또는 관심 분자가 삭제되거나 변경된 돌연변이 마우스를 사용할 수 있습니다.

  1. 2-3분 동안 분당 케이지 부피의 10%-30%를 변위시키는 유속으로 CO2 챔버에서 마우스를 안락사시킵니다. 그런 다음 경추 탈구와 같은 2차 안락사 방법을 수행합니다. 해당되는 경우 모든 추가 시설, 기관 및 정부별 지침 및 규정을 따릅니다.
  2. 뒷다리 뼈를 회수하기 위해 마우스를 해부합니다.
    1. 복부가 노출되도록 마우스를 등에 고정합니다. 뒷다리와 복부를 살균하기 위해 70%(vol/vol) 에탄올을 분사합니다.
      주의: 에탄올은 가연성입니다. 화염에 가까이 두지 마십시오.
    2. 가위를 사용하여 복부 정중선을 절개하고 대퇴골이 보이도록 다리 쪽으로 계속 자릅니다.
    3. 오른쪽 뒷다리를 잡고 피부를 몸에서 정중선 쪽으로 당깁니다. 내전근을 정중선 쪽으로 절단하여 다리를 몸에서 분리합니다. 그런 다음 고관절과 척추 사이의 다리를 자릅니다. 그런 다음 발목 말단부의 발을 자르고 피부를 벗겨내고 약간 열린 가위로 종아리 조직을 벗겨내어 뼈에서 여분의 조직을 제거합니다.
    4. 에탄올을 70%(vol/vol) 적신 수건에 다리를 놓고 경골과 대퇴골을 절개합니다.
      1. 경골과 대퇴골을 각각 별도의 집게 세트로 걸쇠를 씌웁니다. 경골을 무릎 관절의 자연스러운 방향에 부드럽게 누릅니다. 이렇게 하면 경골이 무릎에서 부러집니다.
      2. 필요한 경우 집게와 해부 가위를 사용하여 남아 있는 매달린 조직을 제거합니다. 나중에 사용할 수 있도록 경골을 에탄올에 적신 수건 위에 올려 보관하십시오.
      3. 같은 방법으로 무릎을 잘라내어 대퇴골을 모으십시오.
    5. 왼쪽 다리에 대해 위의 3단계와 4단계를 반복하여 몸에서 다리를 제거하고 경골과 대퇴골을 절개합니다.
    6. 뼈에 70%(vol/vol) 에탄올을 뿌립니다.
    7. 에탄올을 70%(vol/vol) 적신 깨끗한 수건에 뼈를 깔고 수건으로 살이 많은 부분을 짜낸 다음 수건으로 뼈에 문질러 여분의 조직을 제거하여 뼈를 청소합니다.
  3. 양쪽 대퇴골과 양쪽 경골이 깨끗해지면 4개의 뼈에 모두 70%(vol/vol) 에탄올을 뿌립니다. 멸균된 페트리 접시에 뼈를 모으고 접시에 담긴 배지를 부드럽게 휘젓아 10mL의 BMDM 배양 배지로 헹굽니다.
  4. 10mL 주사기에 10mL의 새 BMDM 배양 배지를 채우고 25G 바늘을 부착합니다.
  5. 집게를 사용하여 경골을 집습니다.그런 다음 발목 관절을 ~45° 각도로 자릅니다.
  6. 경골에서 골수를 씻어냅니다.
    1. 경골의 좁은 끝이 아래를 향하도록 50mL 튜브 위에 경골을 잡습니다. 채워진 주사기에서 경골 위로 미디어를 분배합니다.
    2. 골수 상단 끝에 바늘을 삽입하고(처음에는 부드럽게) 배지를 분배합니다.
    3. 바늘을 제거했다가 다시 삽입하십시오. 짧고 높은 압력으로 밀어 배지를 분배하고 바늘을 골수로 이동합니다.
    4. 배지가 뼈 바닥에서 흘러나오기 시작하면 짧고 높은 압력으로 밀어 세포를 계속 씻어냅니다. 이 과정에서 뼈의 색상을 모니터링하고 뼈가 흰색이 되면 폐기합니다.
    5. 두 경골 모두에 대해 이 작업을 수행합니다.
  7. 대퇴골에 대해 위의 5단계와 6단계를 반복하여 발목 관절에서 경골을 절단한 것처럼 고관절을 절단합니다. 골수를 세척할 때 동일한 50mL 튜브를 사용하여 BMDM 배양 배지를 수집합니다.
  8. 4개의 뼈를 모두 세척한 후 10mL 주사기에 18G 바늘을 통해 50mL 튜브의 골수와 배지를 위아래로 3배 흡인하고 매번 튜브의 측면을 헹궈 골수를 분산시킵니다.
  9. BMDM 배양 배지를 사용하여 50mL 튜브의 최종 부피를 30mL로 조정하고 세포가 완전히 부유하도록 합니다.
  10. 70μm 세포 스트레이너를 사용하여 50mL 튜브에서 BMDM 배양 배지를 여과합니다.
  11. 골수 전구 세포를 포함하는 생성된 세포 현탁액을 각각 10mL(또는 ~20 × 106개 세포)를 추가하여 3개의 150mm 조직 배양 접시에 플레이트합니다. 그런 다음 각 접시에 BMDM 배양 배지 10mL를 추가로 추가합니다. 37 °C의 가습 인큐베이터에서 배양합니다.

3. 실험을 위한 BMDM 차별화 및 도금

  1. 도금된 골수 전구 세포를 37°C에서 3일 동안 배양합니다. 그런 다음 각 접시를 제거하고 BMDM 배양 배지 5-8mL를 추가로 추가합니다(표 1). 37°C에서 인큐베이터로 돌아갑니다.
  2. 초기 도금 후 5일째에 각 접시를 제거하고 BMDM 배양 배지 5mL를 추가로 추가합니다. 37°C에서 인큐베이터로 돌아갑니다.
  3. 6일째에 각 접시를 제거하고 미디어를 버립니다. 그런 다음 10mL의 차가운(4°C에서 보관) 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 한 번 세척합니다. 10mL의 차가운 PBS 세척제는 버리십시오. 그런 다음 각 접시에 신선하고 차가운 PBS 10mL를 넣고 각 접시를 얼음에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세 가지 접시의 세포를 하나의 50mL 튜브에 부드럽게 긁어냅니다. 270 × g에서 4 ° C에서 5 분 동안 셀을 부드럽게 회전시킵니다. 그런 다음 상층액을 버리십시오.
  5. BMDM 배양 배지 20mL를 추가하고, 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁하고, 세포를 계수합니다.
    메모: 각 마우스는 약 60 × 10 6-100 × 10 6 세포를 산출할 것으로 예상됩니다.
  6. 원하는 체외 세포 사멸/염증 자극 분석을 위한 12-well plate 레이아웃을 계획합니다. 웰당 1 × 106 셀을 플레이트할 계획입니다. 계획된 각 자극에 대해 최소 3개의 생물학적 복제물을 포함하고, 카스파제 용해 완충액에서 수확할 웰 한 세트와 RIPA 완충액에서 수확할 웰 두 번째 세트를 플레이트에 넣습니다.
  7. 12웰 플레이트의 웰당 1mL의 BMDM 배양 배지에 있는 플레이트 1 ×10 6개 세포. 세포 사멸/염증 평가를 진행하기 전에 37°C의 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후 배지를 제거하고 각 웰에 1mL의 따뜻한(37°C) PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다.
  8. PBS 세척제를 제거하고 항생제가 포함된 BMDM 자극 매체 500μL(비박테리아 자극을 수행하는 경우) 또는 항생제가 없는 BMDM 자극 매체(박테리아 자극을 수행하는 경우)를 추가합니다(표 1). 체외 자극/감염을 위해 4단계로 이동하기 전에 2시간 동안 배양합니다.

4. 세포 자극 또는 감염

주의: 이 프로토콜에 포함된 제제는 잠재적으로 병원성이므로 관련 기관 및 정부 당국의 승인을 받아 생물안전 레벨 2(BSL2) 시설에서 적절한 예방 조치에 따라 처리해야 합니다.

  1. 관심 유발 요인으로 세포 사멸을 활성화하도록 BMDM을 자극합니다.
    메모: 이 프로토콜의 목적을 위해 인플루엔자 A 바이러스(IAV), 단순 헤르페스 바이러스 1(HSV1), Francisella novicida, LPS + ATP가 예시로 사용되지만, 다른 유발 요인도 사용될 수 있습니다.
    1. 자극 예시 1: IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) 감염(Hoffmann et al.에 따라 구성됨, 감염의 다중성[MOI] 측정에 대한 바이러스 역가는 MDCK 세포의 플라크 분석으로 계산됨):
      1. 방정식 (1)과 방정식 (2)를 사용하여 20 PFU(Plaque-Forming Unit)의 MOI(Multiplicity of Infection)에서 감염에 필요한 바이러스의 양을 계산합니다
        figure-protocol-1
        figure-protocol-2
        figure-protocol-3
    2. BMDM에서 배지를 제거하고 500μL의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 각 웰에 열 비활성화 소 태아 혈청, (HI)-FBS가 없는 고포도당 DMEM에 450μL의 IAV(20 MOI)를 추가합니다. 흡수를 위해 가습 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
    3. 플레이트를 제거하고 50μL의 HI-FBS를 추가합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 다시 넣습니다.총 12시간 동안 배양합니다.

5. 카스파제 웨스턴 블롯에 사용할 상층액과 단백질 용해물을 모으

기
  1. 4시간, 12시간 또는 16시간의 배양 후(구체적인 시기는 사용된 트리거에 따라 다름) 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
  2. 상층액 150μL를 제거하고 다른 상층액 분석(예: 효소 결합 면역흡착 분석[ELISA])을 위해 이를 폐기하거나 보관하십시오. 남아 있는 상층액을 제거하지 마십시오.
  3. 웰당 50μL의 카스파아제 용해 완충액 + 100μL의 4x SDS 완충액을 결합하여 단백질 수집 용액을 만듭니다(표 1). 그런 다음 각 웰에 150μL의 혼합물을 추가합니다.
  4. 각 웰에 대해 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 용해된 세포와 상층액을 수집합니다. 피펫팅하는 동안 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어내어 세포를 파괴합니다. 긁어내고 피펫팅한 후 단백질 용해물을 라벨이 부착된 1.5mL 튜브에 모읍니다.
  5. 열 블록을 사용하여 모든 튜브를 100분 동안 12°C로 가열합니다.
  6. 실온에서 30초 동안 14,500 × g에서 원심분리하여 불용성 성분을 펠릿화합니다.
    참고: 이것은 일시 중지 지점입니다 - 결합된 상등액과 단백질 용해물의 단백질은 즉시 사용하거나 -20°C에서 최대 2개월 동안 보관하거나 -80°C에서 사용할 준비가 될 때까지 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
표시기
범주시약준비발언안전 예방 조치
미디어L929 배양 배지1) FBS를 가열합니다(비고 참조).
2) Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM) 43.5mL, 열 비활성화 소 태아 혈청(HI-FBS) 5mL, 피루브산 나트륨 0.5mL, 비필수 아미노산 0.5mL, 페니실린 및 스트렙토마이신 0.5mL를 결합합니다.		56°C에서 30분 동안 배양하여 FBS를 가열합니다.
골수 유래 대식세포(BMDM) 배양 배지IMDM 290mL, L929 컨디셔닝 배지 150mL, 비필수 아미노산 5mL, HI-FBS 50mL, 페니실린 및 스트렙토마이신 5mL를 결합합니다.사용하기 전에 매체를 물 또는 구슬 수조에서 37°C로 데우십시오. 배지는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
항생제를 사용한 BMDM 자극 매체Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) 445mL, HI-FBS 50mL, 페니실린 및 스트렙토마이신 5mL를 결합합니다.사용하기 전에 매체를 물 또는 구슬 수조에서 37°C로 데우십시오. 배지는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
항생제를 사용하지 않는 BMDM 자극 매체450mL의 DMEM과 50mL의 HI-FBS를 결합합니다.사용하기 전에 매체를 물 또는 구슬 수조에서 37°C로 데우십시오. 배지는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
감염 매체(HI-FBS 없음)495mL의 고혈당 DMEM을 5mL의 페니실린 및 스트렙토마이신과 결합합니다.사용하기 전에 매체를 물 또는 구슬 수조에서 37°C로 데우십시오. 배지는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
나트륨 도데실 설페이트(SDS) 완충액1M 트리스 버퍼
(SDS 버퍼 4개)		1) 트리스 12.11g을 탈이온수 80mL에 녹입니다.
2) 교반하면서 HCl 방울을 추가하여 pH를 6.8로 조정합니다.
3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 100mL로 조절합니다. 		버퍼는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.HCl은 부식성입니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다. HCl은 흄 후드에서 처리해야 합니다.
SDS 버퍼 4개1) 1M Tris(pH 6.8) 용액 60mL, SDS 24mg, 브로모페놀 블루 100mg, 글리세롤 120mL, β-메르캅토에탄올(BME) 8.4mL, 탈이온수 90mL를 혼합합니다. 2) 소금이 용액에 들어갈 수 있도록 따뜻한 교반 플레이트에서 저어줍니다. 3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 300mL로 조절한다.완충액은 분주하여 최대 1년 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.SDS는 부식성이고 BME는 발암성입니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다. SDS 및 BME는 흄 후드에서 처리해야 합니다.
Caspase 용해 버퍼1M 1,4-디티오트레이톨(DTT)DTT 분말 0.154g을 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL에 용해시킵니다. DTT가 솔루션에 들어갈 수 있도록 허용합니다.완충액은 200μL 분취량으로 분주할 수 있으며 최대 1년 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
Caspase lysis 완충액탈이온수 35mL, NP-40 4mL, 1M DTT 750μL, 프로테아제 억제제 정제 1정 및 인산가수분해효소 억제제 정제 1정을 결합합니다.버퍼는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) 버퍼1.5M 트리스 버퍼
(RIPA 버퍼의 경우)		1) Tris 18.2g을 탈이온수 80mL에 녹입니다.
2) 교반하면서 NaOH 한 방울을 첨가하여 pH를 8.8로 조정합니다.
3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 100mL로 조절합니다.		버퍼는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.NaOH는 부식성이며 화상을 유발할 수 있습니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다.
10%(중량/부피) SDS 솔루션
(RIPA 버퍼의 경우)		1) 탈이온수 80mL에 SDS 10g을 추가합니다.
2) 녹을 때까지 저어줍니다 .
3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 100mL로 조절합니다.		이 용액은 최대 6개월 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 용액이 침전되면 부드럽게 가열하여 다시 용해시킵니다.SDS는 부식성입니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다. SDS는 흄 후드에서 처리해야 합니다.
RIPA 버퍼
(재고 2개)		1) 탈이온수 46mL에 0.5g의 데옥시콜레이트 나트륨, NP-40 1mL, NaCl 0.876g, 1.5M Tris(pH 8.8) 3.3mL 및 10%(wt/vol) SDS 1mL를 결합합니다.
2) 녹을 때까지 저어줍니다 .
3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 50mL로 조절한다.		2x RIPA 재고는 최대 1개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.SDS는 부식성입니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다. SDS는 흄 후드에서 처리해야 합니다.
멸균 트리거증권 시세동결건조된 LPS를 대장균 0111:B4의 내독소가 없는 물에 5mg/mL의 농도로 용해합니다.이 용액은 최대 2년 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
0.5 M ATP동결건조된 ATP 1g을 내독소가 없는 물 3.63mL에 녹입니다.용액은 분주하여 최대 2년 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
웨스턴 블로팅 솔루션버퍼
실행 (재고 5배)		1) 900mL의 탈이온수에 Tris 염기 15g, 글리신 72g, SDS 5g을 결합합니다.
2) 미립자가 남지 않을 때까지 저어줍니다.
3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 1L로 조정합니다.		버퍼는 최대 6개월 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.SDS는 부식성입니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다. SDS는 흄 후드에서 처리해야 합니다.
전송 버퍼
(재고 10배)		1) 30.3g의 트리스 베이스와 72g의 글리신을 탈이온수 900mL에 결합합니다.
2) 미립자가 남지 않을 때까지 저어줍니다.
3) 탈이온수를 넣어 최종 부피를 1L로 조정합니다.		버퍼는 최대 3개월 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.
Tween 20을 사용한 트리스 완충 식염수(TBST)1) 2.42g의 Tris 염기와 8.76g의 NaCl을 850mL의 탈이온수에 용해시킵니다.
2) 교반하는 동안 HCl 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정합니다.
3) 탈이온수를 추가하여 최종 부피를 1 L.
로 조정합니다. 4) Tween 20 0.5 mL를 첨가합니다(최종 농도 0.05%(vol/vol)).		용액은 실온에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.HCl은 부식성입니다. 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 여기에는 실험복과 장갑이 포함됩니다. HCl은 흄 후드에서 처리해야 합니다.
5%(wt/vol) 탈지 우유 차단 용액무지방 분유 5g을 100mL TBST에 녹입니다.이 용액은 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
일차 항체Caspase-1 일차 항체5%(wt/vol) 탈지 우유 차단 용액 10mL에 항체 10μL를 첨가하여 항-카스파제-1 항체를 1:1,000(vol/vol)로 희석합니다.최적의 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 새로 만드십시오. 그러나 이 솔루션은 효과 손실 없이 최소 3회 사용할 수 있습니다. 재사용하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
Caspase-11 일차 항체5%(wt/vol) 탈지 우유 차단 용액 10mL에 항체 10μL를 첨가하여 항 카스파제-11 항체를 1:1,000(vol/vol)로 희석합니다.최적의 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 새로 만드십시오. 그러나 이 솔루션은 효과 손실 없이 최소 3회 사용할 수 있습니다. 재사용하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
Caspase-3 1차 항체동일한 10mL의 5%(wt/vol) 탈지유 차단 용액에 각 항체 10μL를 첨가하여 항-카스파제-3 항체와 항-절단된 카스파제-3 항체를 1:1,000(vol/vol)로 희석합니다.최적의 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 새로 만드십시오. 그러나 이 솔루션은 효과 손실 없이 최소 3회 사용할 수 있습니다. 재사용하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
Caspase-7 1차 항체동일한 10mL의 5%(wt/vol) 탈지유 차단 용액에 각 항체 10μL를 첨가하여 항-카스파제-7 항체와 항-절단된 카스파제-7 항체를 1:1,000(vol/vol)로 희석합니다.최적의 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 새로 만드십시오. 그러나 이 솔루션은 효과 손실 없이 최소 3회 사용할 수 있습니다. 재사용하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
Caspase-8 1차 항체동일한 10mL의 5%(wt/vol) 탈지유 차단 용액에 각 항체 10μL를 첨가하여 항-카스파제-8 항체와 항절단 카스파제-8 항체를 1:1,000(vol/vol)으로 희석합니다.최적의 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 새로 만드십시오. 그러나 이 솔루션은 효과 손실 없이 최소 3회 사용할 수 있습니다. 재사용하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
Caspase-9 1차 항체5%(wt/vol) 탈지 우유 차단 용액 10mL에 항체 10μL를 첨가하여 항 카스파제-9 항체를 1:1,000(vol/vol)로 희석합니다.최적의 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 새로 만드십시오. 그러나 이 솔루션은 효과 손실 없이 최소 3회 사용할 수 있습니다. 재사용하는 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
HRP-conjugated β-actin 1차 항체5%(wt/vol) 탈지 우유 차단 용액 10mL에 항체 2μL를 추가하여 항β-액틴 항체를 1:5,000(vol/vol)로 희석합니다.이 항체는 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다.
2차 항체와 관련상품토끼 항체양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합 2차 항체를 1:5,000 (vol:vol)로 희석하여 5%(wt/vol) 탈지유 차단 용액 10mL에 항체 2μL를 첨가합니다.항체 희석액은 매번 신선하게 준비해야 합니다.
안티 마우스 항체5%(wt/vol) 탈지유 차단 용액 10mL에 항체 2μL를 첨가하여 HRP 접합 2차 항체 1:5,000(vol:vol)을 희석합니다.항체 희석액은 매번 신선하게 준비해야 합니다.
항-쥐 항체5%(wt/vol) 탈지유 차단 용액 10mL에 항체 2μL를 첨가하여 HRP 접합 2차 항체 1:5,000(vol:vol)을 희석합니다.항체 희석액은 매번 신선하게 준비해야 합니다.

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공개 사항

선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.45μm 필터밀리포어SCHVU05RE
10mL 주사기BD 바이오사이언스309604
12웰 플레이트 코 닝07-200-82
18 G 바늘 BD 바이오사이언스305195
바늘 25G BD 바이오사이언스305122
50 mL 튜브 피셔 사이언티픽전화: 50-809-218
70 μm 세포 스트레이너 코 닝431751
150mm 조직 배양 접시코 닝430597
182-cm2 조직 배양 플라스크제네시 사이언티픽25-211
ATP인비보젠TLRL-ATPL
BBL 트립티카제 콩 육수BD 바이오사이언스211768
구슬 목욕Chemglass 생명 과학CLS-4598-009
바이오 광도계 D30에펜도르프6133000010
셀 스크레이퍼CellTreat Scientific 제품229315
CO2 챔버베트핍901703
큐 벳피셔 사이언티픽Tel.: 14-955-129
가위 해부써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific221초
DMEM을 참조하십시오.써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific11995-073
에탄올팜코111000200
소 태아 세럼 바이오웨스트S1620
여과지바이오 라드1703965
집게피셔 사이언티픽제22-327379
Francisella novicida (U112 균주)BEI 리소스NR-13
겐타마이신지브코15750060
히트 블록피셔 사이언티픽제23-043-160
단순 헤르페스 바이러스 1 (HF 균주)증권 시세VR-260
고포도당 DMEM 시그마D6171
가습 인큐베이터 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific51026282
국제경영시스템(IMDM써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific제12440-053
인플루엔자 A 바이러스(A/푸에르토리코/8/34, H1N1[PR8]) Hoffmann et al.에 따라 건설되었습니다.
L929 셀증권 시세CCL-1L929 컨디셔닝 배지 생성을 위한 세포주
L-시스테인 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificBP376-100
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